流式进阶秘籍（三）— 几个步骤跟着走，多色实验成功做

市面上的流式仪器琳琅满目，首要确定仪器配置—激光和滤光片！仪器配置的滤光片决定了您的实验中可以选用哪些荧光染料，Bio-Rad ZE5流式细胞分析仪最高可配置5个激光，27个荧光检测通道。让您可以比较自由地选择荧光素，极大简化了您配色的难度。

此外，分辨率对获得准确且漂亮的流式结果图意义重大。分辨率是指区分阴性群和阳性群的能力，其取决于仪器及染料的兼容性和门控。ZE5有较高的分辨率，即使在高达3.5 μl/s的流速下，都能保持较高的分辨率。

图1 随着流速增加，ZE5仍保持很高的分辨率

在确定好仪器后，需要综合考虑实验方案。首先，您需要清楚您的实验目的，您需要查阅文献和资料，明确您需要检测哪些抗原的表达。随后，为需要检测的抗原搭配上合适的荧光染料，这个过程即为多色配色。这个步骤关键且挑战，我们精心整理了干货技巧助您一臂之力。

Tip1：强弱搭配，出图不累

染料亮度有高有低，每个抗原在细胞上的表达有强有弱，若有外界条件的干扰，某些抗原的表达量也会发生变化，来表征机体对外部干扰的反应。

图2 用相同荧光素SBV440标记不同抗原（CD28，CD2，CD3，CD45RA），抗原表达密度不同，染色表现各不相同

对于表达丰度较低的抗原，搭配高亮度的染料会更容易将其从背景信号中区分出来。

图3 使用不同荧光素标记的CD56进行染色

Tip2：荧光溢出，不可小觑

由于荧光之间，尤其是相邻通道或者是使用相同滤光片通道的荧光之间，经常会出现荧光的溢漏。这会干扰到其他通道的信号，因此需要通过补偿调节来消除溢漏。但在补偿调节之后，细胞群可能会出现一些被拉长或者拉宽的情况。

图4 Spread对细胞群的分辨率有影响

随着多色流式中使用染料数量的增加，这种现象会更加明显。尤其是鉴定细胞上共同表达的两个指标时，细胞亚群会出现分辨率降低的现象，甚至还会影响设门，引起误差较大的检测结果。因此，鉴定目标细胞群共同表达的指标时，应尽量搭配荧光干扰较少的荧光素。

图5 不同荧光素标记的CD25和不同荧光素标记的CD127会影响T_reg细胞的染色表现

说到这就不得不请我们Bio-Rad StarBright 染料闪亮登场了，该系列的染料不仅稳定，而且亮度很高，值得一提的是染料的激发光和发射光谱非常窄，极大降低光谱之间的重叠，可有效的降低荧光溢出，是多色方案的极佳选择。

图6 Starbright染料优势

Tip3：排除死细胞，结果更明确

死细胞具有较高的自发荧光，会增加背景噪声。另外死细胞容易与抗体进行非特异性结合，造成假阳性，如图7所示在散点图的45°角可以明显地观察到死细胞。

图7 死细胞出现在散点图的斜对角线上，排除死细胞后该群细胞消失

在多色流式实验中，对于膜表面抗原的检测，可以选用核酸类死活染料（如PI,7-AAD,DAPI）。在检测胞内或者核内指标时，需要对细胞进行固定破膜，此时需要选择可以进行固定的蛋白类死活染料（如VivaFix染料）。该类染料的检测原理是结合细胞表面及死细胞内的伯胺基团，因此死细胞的荧光亮度明显高于活细胞，可以获得区分度很高的阴阳两群细胞。并且该类染料有多个通道可以选择，可灵活搭配到多色配色方案中。

图8 VivaFix死活染料对新鲜样本和固定样本的染色结果一致

至此，配色工作结束，方案搭建只差最后的工作---设置对照

染色中的非特异性荧光会导致背景增加，另外多色流式实验使用的染料较多，染料之间会存在一些相互的影响和干扰。因此合理的对照可以进一步增加设门的准确性，获得比较准确的阳性群体。在流式细胞术中需要使用到的对照有未染色对照，Fc封闭对照，同型对照，FMO对照，单染对照，生物学对照等，详细对照的介绍可参考文章开始处领取的流式秘籍。

图9 多色流式细胞术的点图显示，与未染色的对照相比，荧光扩散到 FMO对照显示的 PE-Cy5 通道中。黑色虚线表示 FMO 门控边界，而红色虚线表示未染色边界。

根据搭配好的配色方案以及样本数量采购合适的流式抗体，完成细胞样本的染色，根据实验方案选择合适的抗体孵育温度及时间。

在使用抗体前，推荐进行浓度滴定。以此来确定最佳用量，帮助优化流式实验结果，也可以节省抗体。如下图中检测的CD8 SBV710，使用推荐用量的一半甚至四分之一便可以获得非常高的染色指数。

图10  抗体滴定。绘制每种抗体浓度的染色指数图将有助

于滴定用于实验的最佳抗体量。SBV， StarBright Violet。

抗体孵育结束后，需要及时上机检测，如果无法马上上机，需要避光放置在4℃中保存，避免荧光信号的降低，随后尽快上机做样本检测。通过调节合适的电压和补偿，搭配方案中设置的对照，去寻找正确的阳性信号。

跟着上述步骤操作，结合流式秘籍中的详细指导，可助您轻松搞定多色流式实验。

图11 使用Bio-Rad ZE5流式细胞仪和StarBright等染料标记的抗体，检测人外周血样本的18色方案数据结果。