【应用文章】FLIPR高通量实时荧光成像分析系统应用--钙流检测

Fura-2 QBT™钙流试剂盒: 新型均相Fura-2 钙流检测实验

特点

1. 基于信号湮灭技术，获得更大信号窗口

2. 免洗和比值法信号检测使得实验差异性降至最低

3. 免洗步骤节省了时间和实验成本

实验原理

Fura-2 AM 是一种钙离子敏感染料，在340nm 和380 nm 被激发，发射波长是510 nm。染料结合了钙离子后其吸收波长从380nm 转移到340nm。图1 显示了钙离子结合Fura-2后340/510nm 发射的信号（绿）的增加，而380/510 nm 发射的信号（橙）下降。计算两种发射的信号比值（插图）来检测用于拟合量效曲线的最大值减去最小值后的信号效应。

Fura-2 QBT™钙流实验准备

本次实验中使用的是小规格的Fura-2 QBT™钙流试剂盒（PN #R8197）。染料重悬在含有20 mMHEPES 的 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）。 丙磺舒（PBX）在需要时加入，用以抑制染料被转移出细胞内。贴别的CHO M1 细胞或HeLa 细胞实验前过夜种在黑壁底透的384 孔板中，在试验时从培养箱中取出。含有Fura-2 QBT 染料或者其它染料的25μL 缓冲液加入到每个孔中，同时孔中需含有25μL 缓冲液或培养基。加载了Fura-2QBT™钙流试剂（PN #R8197）或BD 比值法钙流试剂（#644243）的细胞记录板在37°C、5%CO2 孵育一小时。为便于对比，采用了传统的Fura-2 清洗方法。

FURA-2 QBT 钙流实验的比值法分析 (图1)

按照此传统的Fura-2 清洗方法，在加入50μL 的1X 染料缓冲液之前去除每个孔中的培养基，然后去其它试剂盒一样细胞记录版在同样的条件和时间下进行孵育。在FlexStation®3 微孔读板机或FLIPR® Tetra 系统上开始记录前，所有记录板从培养箱中取出并降温至室温10 分钟。采用了传统Fura-2 清洗方法的记录板需要在开始记录前用HBSS 实验缓冲液清洗3 次以去除多余的染料。

FlexStation 3 和FLIPR Tetra 系统上的比值法钙流检测实验

在384 孔的聚丙烯化合物板中将5 倍浓度的相应配体溶于含20mMHEPES 的HBSS 缓冲液中。在FlexStation3（图2）或FLIPRTetra系统（图3）检测过程中加入激动剂，仪器参数进行了优化以适应于比值法检测实验。染料的激发波长是340nm和380nm。在510 nm 检测到发射信号，每个孔中两个激发波长下的相对荧光单位（RFU）的记录持续大约90 秒，包括加样前和加样后。实验中每个采样时间点的计算后的输出结果是340nm 与380nm 波长信号的比值。最大值减去最小值的计算来源自比值信号曲线。量效曲线和EC50/IC50 浓度统计计算所需的数据从ScreenWorks®或SoftMax® Pro软件中输出， 然后用GraphPad Prism 进一步拟合和计算。 根据Zhang, et. al 发表的方法进行.Z值的计算。

Results 结果

Conclusions 结论

相对于传统Fura-2 实验，Fura-2 QBT™钙流试剂盒提供了均相的实验体系，通过使用Molecular Devices 公司基于信号湮灭的专利技术无需再对细胞进行冲洗。因此将提高通量、减小细胞铺板或冲洗时细胞丢失等造成的实验差异性，并节省了实验成本（因为差异性而需要重复实验带来的缓冲液和耗材）。相比于BD 比值法钙流试剂盒（#644243）传统的Fura-2 细胞冲洗实验，Fura-2 QBT™钙流试剂盒可得到最大的信号窗口以及在EC80 或IC80 下最好的Z 值。因为Fura-2 燃料在紫外范围激发，从而避免了化合物488nm 激发的自发荧光的干扰。Fura-2 QBT™钙流试剂盒在FLIPRTetra 系统和FlexStation 3 微孔板检测平台上进行了充分的验证，提供了可重复、可量化操作的解决方案，适合于高通量的筛选工作。

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