培养基及补料策略对 CHO 细胞生长及抗体质量的影响案例分享

本研究案例使用化学成分限定的 CHO 细胞培养基及补料策略对不同细胞系进行 batch 和 fed-batch 培养，考察对细胞代谢、抗体浓度及质量的影响。

采用生产相同抗体的 CHO-K1、CHO-DG44 和 CHO-S 细胞系在 ActiPro（GE HyClone）and Media A 培养基中，使用特定浓缩补料进行 batch 和 fed-batch 培养，研究分析不同培养基及补料对于抗体产量、细胞生长、细胞特异性的营养消耗、副产物成分及 IgG 质量的影响。

表 2. 实验准备材料（A）和Fed-batch补料方案（B）

注：补料时间和补料比例（补料体积/培养体积）已经预设，ActiPro 在培养第 3 天开始补料。

每天抽取样品以确定细胞浓度，活力，IgG 滴度，代谢物（包括葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸、铵），渗透压。 此外，在第 4 天（指数中期生长期），第 7 天（结束指数生长期）和培养终止日（活力<60％），通过流式细胞仪分析残留氨基酸浓度，基因拷贝数和 mRNA，细胞内产物含量，通过 SDS-PAGE，Western 印迹，糖基化，聚合体，电荷异构体和热稳定性等分析抗体质量。

每个试验组均做三份平行， 通过加入葡萄糖浓缩液将残留葡萄糖浓度维持在 3 g / L 以上。

相比 batch 培养模式，fed-batch 策略可显著延长培养持续时间，提高细胞峰浓度，抗体终浓度可提高至六倍以上（数据未显示）。

如图 1 所示，当 ActiPro 用作三种重组细胞系（CHO-K1，CHO-DG44 和 CHO-S）的基础培养基时，可获得最高的细胞密度和抗体浓度。ActiPro 中较高的比生长速率带来较高的细胞峰密度和活细胞积分（高达五倍差异）。两种培养基中细胞生长比较发现 IgG 滴度高达六倍的差异（图 1B）。IgG 产生的特定速率与三种 CHO 细胞系细胞内轻链和重链 mRNA 表达水平非常一致（数据未显示），ActiPro 在 fed-batch 模式中较高的活细胞积分是获得更高抗体浓度的主要原因。

图 2. fed-batch 培养模式下（A）细胞密度曲线和（B）抗体浓度曲线。CHO-K1 (蓝色), CHO-S (橙色) and CHO-DG44 (灰色) 在 ActiPro 生长以连续实线表示，在 Media A 生长以非连续虚线表示。

本案例中两种 fed-batch 策略明显影响细胞代谢速率，包括营养物质消耗和副产物形成（数据未显示）。培养于 Medium A 中时，三种细胞系的葡萄糖消耗率均高达 30-55%，而且具有细胞特异性。同时三种细胞系葡萄糖转化为乳酸的比例也具有明显差异，其中 CHO S 细胞最低，约为 10-15%，CHO-DG44 细胞 为 25%, CHO-K1 细胞中葡萄糖转化为乳酸的比例最高，可达 40%。

谷氨酰胺是 CHO 细胞的主要能量来源，谷氨酰胺消耗为高度宿主细胞特异性，同种细胞系在两种培养基中消耗比例大致相同。三种细胞系在 Media A fed-batch 培养中谷氨酰胺均为净消耗，而在 ActiPro 培养物中则观察到净生成，这一发现可能会影响未来补料策略的设计。两种培养基中，CHO-K1 细胞系铵生成率保持不变，而在 CHO-S 和 CHO-DG44 细胞系中，ActiPro 相比 Media A 铵生成率低 30-60％。

所有三份 fed-batch 培养物的培养上清液进行纯化，通过不同技术分析抗体质量。所有样品在 SDS-PAGE 上看起来均一，纯度高且具有正确的分子量，通过 SEC 测定聚合体小于 5％（数据未显示）。抗体 Fc 结构域的糖基化变化与 CHO 细胞系的使用以及补料策略有关（数据未显示），通常高岩藻糖化出现在 CHO-S 细胞系及 Media A 培养基 fed-batch 培养中，CHO-S 和 CHO-K1 细胞系培养于 ActiPro 生产的抗体有更高水平的半乳糖化，甘露糖结构在 CHO-S 中被最有效地加工（最低的高甘露糖结构），然后是 CHO-K1 和 CHO-DG44。

本案例中细胞培养基和补料策略对抗体生产过程及产量影响大，不同培养基间细胞峰值密度有 5 倍差别，抗体滴度高达 6 倍差别。细胞代谢速率（例如葡萄糖和谷氨酸）也受培养基的影响，乳酸生产及谷氨酰胺消耗（均有细胞特异性）主要取决于 CHO 细胞系。对于产品质量，培养基和 CHO 宿主细胞系的选择均可用于微调抗体糖基化，例如岩藻糖基化，半乳糖基化和甘露糖基化等。