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ActiPro
细胞生产培养基预期与Cell Boost 7a和7b添加剂组合使用，用于提高分批培养或灌注培养工艺中重组蛋白的生产。本文展示了分批培养工艺在生产单克隆抗体(mAb)用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中的发展情况。研究结果着重强调正确补料策略对于实现最佳细胞生长和产率的重要性。
引言
ActiPro培养基和补料被开发用于为CHO细胞在重组蛋白生物制造中的高生产率提供支持，这些产品在各种CHO细胞系中表现出卓越的效果(1)。ActiPro生产培养基和Cell Boost补料设计为一起结合使用。补料添加剂采用优势互补设计，建议的Cell Boost 7a和7b的比率为10/1 (v/v)。开始时，建议的Cell Boost 7a和7b补料体积占总体积比例分别为3%和0.3%。在先前的实验中，该补料策略最适合高效价mAb生产CHO DG44细胞系(内部数据)。然而，补料体积应针对所使用特定细胞群体的营养需求进行调整。本文中，我们开发了一项基于摇瓶的补料策略，用于生产低效价单克隆抗体的CHO-S细胞系。在使用ReadyToProcess WAVE™ 25生物反应器系统后，生物反应器培养生产率进一步得到优化。
材料和方法
细胞系
本研究实施期间使用CHO-S细胞系(获得Cobra Biologics Ltd.许可证)。对于摇瓶培养，细胞在解冻后传代四次，并在接种前培育72小时。对于生物反应器培养，细胞在解冻后传代六次，在接种前培育96小时。
摇瓶中的批次培养
批次培养在灌注有100mL ActiPro培养基的500mL摇瓶中进行。细胞接种密度为0.3 × 106个活细胞/mL。培养物保持在37℃和7.5%的CO2条件下，振荡摇摆速度105 rpm。所有实验实施两次。样品每日采样一次，并测量细胞密度、存活率和生产率，以及代谢物含量。
摇瓶中的分批培养
使用摇瓶进行分批培养以获取最佳补料策略。研究实施期间使用包含起始容积250mL ActiPro培养基的1000mL摇瓶。细胞接种密度为0.3 × 106个活细胞/mL。从第3天开始，按照表1列出的容积，每日添加一次Cell Boost补料添加剂。当葡萄糖浓度下降到2g/L以下时，向培养物中添加葡萄糖。培养物保持在37℃和7.5%的CO2条件下，振荡摇摆速度105 rpm。所有实验实施两次。样品每日采样一次，并测量细胞密度、存活率和生产率，以及代谢物含量。
表1. 摇瓶试验的设置
生物反应器分批培养
双重模式下在ReadyToProcess WAVE 25系统中进行生物反应器培养。将用于双重培养的两个10升Cellbag™生物反应器袋放在相同的摇床上。表2列出了培养物参数。使用UNICORN™系统控制软件对培养物进行控制。
Cellbag生物反应器袋灌注有3升ActiPro培养基，接种细胞密度大约为0.3×106个活细胞/mL。从第3天开始，培养物每日补充一次2%的Cell Boost 7a/ 0.2% Cell Boost 7b，这被视为摇瓶培养的最优方案。从第5天开始，培养物中葡萄糖浓度维持在2g/L。在第14天收获培养物。样品每日采样一次，并测量细胞密度、存活率和生产率，以及代谢物含量。
表2. 10升生物反应器分批培养的培养参数
分析方法
使用Bioprofile FLEX™分析仪(Nova Biomedical Corp.)测量细胞悬液中的细胞密度和存活率、葡萄糖、乳酸、铵盐、谷氨酰胺和谷氨酸浓度水平。使用CEDEX™生物分析仪(Roche)测量澄清培养物中生产的mAb的含量。糖分析由英国斯塔福德郡Cobra Biologics Ltd.实施。电荷异构分布使用阳离子交换色谱法在ProPac WCX-10 2 × 250 mm蛋白柱(Dionex)上测定。
结果
摇瓶培养
图1显示了摇瓶ActiPro培养基分批培养的细胞生长和生产率数据。为测定最佳补料方案，摇瓶培养物补充了Cell Boost 7a和7b，占培养物总体积的比率分别为4%/0.4%、3%/0.3%、或者 2%/0.2%。图2显示了被测试补料容积的细胞生长和生产率数据。结果表明2% Cell Boost 7a/0.2% Cell Boost 7b会实现最佳补料效果，对于选定细胞系能够提供最高的细胞密度和生产率。
图1. 摇瓶分批培养中活细胞密度和生产率
图2. 补充不同容积Cell Boost 7a和7b的摇瓶培养中
活细胞密度和生产率
生物反应器分批培养
图3显示了生物反应器培养物的活细胞密度(VCD)和生产率。实现的峰值VCD为15×106个细胞/mL，生产率为1.6g IgG/L，相比而言，摇瓶达到的VCD为12 × 106个细胞/mL，生产率为1.2g IgG/L。图4显示了代谢物浓度，阐述了培养期间谷氨酰胺、谷氨酸、铵盐、葡萄糖、乳酸盐的浓度。产品质量属性，即培养期间第12、13、14天电荷变量分布和糖基化曲线分别显示在图5和图6中。总之，最后三天培养期间，仅观测到质量属性的细微变化。
摇瓶培养是筛选特殊培养条件的良好工具。然而，许多情形下，由于培养物参数控制更加精确，生物反应器系统能够提供优于摇瓶培养的生长条件。因此，按照我们的预期，生物反应器分批培养的细胞生长和生产率会进一步提升。
图3. 生物反应器分批培养的细胞生长和生产率
图4. 生物反应器分批培养的代谢物浓度
图5. 生物反应器分批培养的电荷变量分布
图6. 生物反应器分批培养的Glycoprofile
结论
本文展示了分批培养工艺在使用ActiPro培养基和添加剂的低产量CHO细胞系中的开发情况。本文评估的Cell Boost 7a/7b的补料比率分别为2.0%/0.2%、3.0%/0.3%、4.0%/0.4%。对于该细胞系，在2% Cell Boost 7a、0.2% Cell Boost 7b条件下，获取了最佳细胞生长性能和生产率。该结果反映出基于特定细胞系营养需求确定正确补料方案的重要性，以避免培养期间过度补料或补料不足。按照所选择补料策略，以及在培养时期内不同培养物之间电荷变量和Glycoprofile分布可能存在显著差异，当选择补料策略以及放大生产工艺时，这些重要的产品质量因素也需要加以考虑。
参考文献：
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