质粒纯化的新篇章

GE生命科学

2019.3.06

作者思拓凡

TA的动态

最近几年基因治疗领域大动作不断，无论是基因治疗药物的陆续上市，还是各大豪门药企（如诺华、罗氏、吉利德、辉瑞、GSK 等）不断加码基因治疗的买买买，每隔一段时间就会有个大新闻抛出来。

基因治疗的核心是基因载体，目前病毒载体占据着绝对主导地位。从世界上第一个腺相关病毒（AAV）基因治疗药物 Glybera，到 GSK 的慢病毒（LV）基因治疗药物 Strimvelis，再到诺华的自体回输 Car-T 细胞治疗和 Spark 的 Luxturna，AAV 和 LV 总是霸占头条，一时瑜亮。由于 AAV 和 LV 大都采用质粒瞬时转染方法生产，高质量、高纯度的超螺旋质粒是制备 AAV、LV 等病毒载体的前提条件。

质粒，一段麻花样的环状超螺旋 DNA是常见的分子生物学工具。抽提质粒几乎是每个生物人的必备技能之一。抽提试剂盒可以提供微克至数毫克级的质粒，足以满足科研需求；但是如果需要大规模制备病毒载体，试剂盒的质粒产量还是杯水车薪。此外，包装病毒通常需要三个质粒或四个质粒，每个质粒大小、序列都不一样，上游表达量也有区别，甚至稳定性都有差异。面对如此众多品种的质粒，一个能够适用多种质粒的、可放大的纯化工艺无疑会带来很大的便利。

接下来就向大家隆重介绍基于 PlasmidSelect 亲和填料的通用型质粒纯化工艺，该工艺可用于 cGMP 环境下的大规模质粒纯化（见图 1）。

图 1 质粒生产工艺流程图

1. 大肠杆菌收获——中空纤维

收集菌体首先想到的当然是离心了，但是放大无疑是离心机的软肋。中空纤维有开放式的通道，能够处理高固含量（大肠杆菌发酵液）、高粘度（菌体裂解液）和剪切力敏感型样品（质粒），并且具有良好的线性放大能力。在这一步推荐使用 750KD 或 0.1、0.2um 的 1 mm 内径的中空纤维进行菌体的收集和清洗。

2. 菌体裂解——碱裂解

菌体裂解方法有很多，常用的是碱裂解。不管碱裂解工艺怎么改，都万变不离其宗，其宗就是上古时期的一篇论文（Birnboim HC, Doly J. Nucleic Acids Res 1979;7(6):1513–23.），不再细述。

3. 裂解液浓缩——中空纤维

当溶液 I、II 和 III 相继加完后，裂解液体积会变得非常大，在层析纯化前进行浓缩和洗滤，不仅可以大大减小样品体积，还可以有效去除 RNA、色素和部分 HCP、HCD 等杂质，减少层析阶段的负荷。对于质粒的超滤浓缩，一般按照如下标准（见表 1）进行 NWMC（GE 中空纤维）的选择，中空纤维的低剪切力特点可以有效保护质粒的超螺旋构象。

表 1 中空纤维的选择推荐

4. 三步层析

前面 blabla 说了那么多，其实层析才是本工艺的精华所在。三步层析工艺的稳健性、合理性和连贯性，均堪称教科书式的经典。第二步层析的 PlasmidSelect Xtra 填料凭借着强大的分离开环和超螺旋质粒的能力，占据三步层析的 C 位！其他两步层析的作用也不可小觑，三步层析功能明确、互相合作。

Sepharose 6FF—RNA removal

提到凝胶过滤，接受过纯化工艺培训的童鞋第一反应都会认为其不易放大、上样体积小、适合最后的精纯阶段。但是本工艺的凝胶过滤却扬长避短、反其道而行，用在了第一步层析。

①裂解液经过浓缩后，体积已经大大减小，凝胶过滤跃跃欲试未尝不可；

② 高浓度硫酸铵的缓冲液让杂质（主要是 RNA）和质粒的空间大小的差异性达到了最大，质粒通过层析柱的外水体积首先流出（使用 2.1 M 硫酸铵缓冲液的另一个精妙之处接下来再介绍）。

组群分离（Group separation）模式使其上样体积达到了 0.3CV，对比精纯阶段凝胶过滤的 1%~5%CV 的上样体积，的确有足够信心在第一步层析施展才华。本步层析以后，质粒已经达到了很高的纯度，琼脂糖凝胶电泳几乎看不到 RNA 杂带。

图 2 Step 1-Sepharose 6 Fast Flow 的实验过程和层析图谱

PlasmidSelect Xtra—oc pDNA removal

PlasmidSelect Xtra 填料从位于 Uppsala 的 GE 实验室开始研发到上市，至今已经超过 15 个年头。PlasmidSelect Xtra 强大的开环超螺旋分离能力，可能只有他的同胞兄弟 Capto PlasmidSelect 能够出马一战。Capto PlasmidSelect 是 PlasmidSelect Xtra 的升级版，二者有相同的嗜硫配基，具有相同的开环超螺旋分离能力，只是基架不同。Capto PlasmidSelect 使用 Capto ImpRes 基架，较 PlasmidSelect Xtra 的 Sepharose HP 基架，可以提供更高的载量、流速和耐压性能。

第一步层析得到的质粒被置换到 2.1 M 硫酸铵的缓冲液，可以直接上样至 PlasmidSelect Xtra 层析柱，在此条件下，开环和超螺旋质粒均与填料结合。上样结束后，用 2.0 M 硫酸铵的缓冲液冲洗层析柱时，开环质粒竟然被冲洗下来，而超螺旋质粒依然牢牢结合在层析柱上，直到用含 1.7 M 硫酸铵和 0.3 M 氯化钠的缓冲液才能将其洗脱。冲洗开环质粒和洗脱超螺旋质粒的两种缓冲液成分有很大的差异，确保了本步工艺的稳健性。PlasmidSelect Xtra 和 Sepharose 6FF 在 2.1 M 硫酸铵缓冲液的导演下无缝对接，在去除 RNA 和开环质粒的过程中一气呵成，不禁为开发此款填料和工艺的科学家点个大写的赞。

图 3 Step 2-PlasmidSelect Xtra 的实验过程和层析图谱

SOURCE 30Q—Endotoxin removal

经过前两步层析，质粒的纯度和均一性（超螺旋比例）达到了新高度，最后一步层析重点是去除内毒素。来源于大肠杆菌，内毒素始终是质粒的一个重要风险杂质。市面上无内毒质粒抽提试剂盒，其内毒素能达到的标准也只有＜100 EU/mg 质粒。

质粒带有高密度的负电荷，可以在高盐浓度下与强阴离子交换填料结合。将 PlasmidSelect Xtra 的洗脱液用水稀释至 3 倍体积，可以上样至 SOURCE 30Q，而内毒素在此高盐情况下不与填料结合，从而实现去内毒的功能。经过此步，内毒素含量可降至＜1 EU/mg。

Tips：如果你手头恰巧没有 SOURCE 30Q，也可以尝试用 GE 其他强阴离子交换填料，如 Sepharose Q FF，Sepharose Q HP，Capto Q 系列，Q Sepharose XL 等，但是上样条件、载量和缓冲液等条件需要重新考察。

图 4 Step 3-Source 30Q 的实验过程和层析图谱

5. 浓缩换液——中空纤维

同裂解液的超滤浓缩一样，推荐使用低剪切力的中空纤维，更好保护质粒的超螺旋构象。

点评

笔者见过不少质粒纯化工艺，但是比较下来，本工艺具有两大强势：

通用性强

亲测适用于 3.0 kbp~30 kbp 大小的质粒（其他大小的质粒未测试过，不代表不可以）。无需做任何工艺改变就可以纯化不同的质粒，真正的通用型平台化工艺，适合生产病毒载体时的多质粒转染体系。

稳健性强

每步层析的载量均可以确定，层析条件也有较大的操作空间范围。裂解液中含有大量的 RNA，其带电荷性质与质粒的类似，如用其他类型层析进行第一步捕获，必须要面对上样载量的问题。不同质粒的上游表达量、RNA 等杂质含量和发酵的批间差异等，均会对确定第一步层析的上样量造成干扰，进而造成工艺不稳定。本工艺的第一步层析使用凝胶过滤，上样量只与样品体积有关，而样品体积取决于前一步的超滤浓缩，简单可控。

2016年，GE生命科学与和元生物技术（上海）股份有限公司开展基因治疗全方位战略合作，建设基因治疗与细胞治疗所需质粒和病毒载体的GMP级生产平台。该平台采用国际最先进的一次性生产技术，安全无污染、快速、生产成本低，适用于多种质粒和病毒产品共线生产。上游工艺采用悬浮培养，微载体培养和细胞工厂三合一的平台，根据项目具体需要选择最佳工艺路线；以先进的超滤浓缩和层析纯化技术，替代传统的离心浓缩纯化工艺，显著提高病毒产品的纯度和生产收率。同时，该GMP生产车间还将建立病毒产品的质量控制体系，开发全面药品中控和放行质控检测方法。

和元上海可以提供如下服务产品：各种质粒载体或者基因治疗药物、腺相关病毒Adeno-associated virus (AAV)、慢病毒Lenti virus (LV)、腺病毒Adeno virus (ADV)、痘病毒Poxvirus (PV)、逆转录病毒Retro virus (RV)、单纯疱疹病毒Herpes simplex virus (HSV)、其它溶瘤病毒Other oncolytic virus；服务种类包括：非注册临床研究用病毒生产、用于中美IND申报的临床前中试样品生产、用于临床研究的重组病毒GMP生产、独立的灌装服务和QC检测服务。