图1 质粒纯化的工艺流程图
01
碱裂解过程的控制要点
NaOH 新鲜配置
控制裂解反应时间
温和高效的混合方式
02
菌体裂解液的前处理
图2 940 g 菌体的 30 L 中和产物中加入 NH₄HCO₃ 的结果
03
ocDNA 与 scDNA 分离条件的优化
04
提高收率的途径
Step
1
Sepharose 6 FF 作为分子筛层析,快速去除大量 RNA,收率一般>90%。柱效与上样体积及样品粘度需合理匹配,以保证纯度与收率
Step
2
Capto Plasmidselect 高效分辨 scDNA 与 ocDNA,收率可>70%。收率低时考虑延长洗脱液的孵育时间
Step
3
Source 30Q 用于精制阶段,利用高分辨率去除痕量内毒素及 gDNA。如果收率低,可以尝试 Capto Q impres,收率可>80%(如下示例)
图3 Capto Q impres 纯化质粒(~6 kb)的色谱图
总
结
随着新的挑战不断出现,质粒的应用成为一种潜在有力的应对手段。而其独特的分子特性及面临的杂质体系,都对工业规模的制备提出了挑战。本文基于大量文献及实践经验,汇总了质粒制备中的难点及要点,以供一线制药同仁参考。
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