细胞治疗技术系列（上） 高密度T细胞扩增的秘密武器 —— 灌流培养技术介绍及实例分享

为了让细胞治疗的生产过程符合法规的要求，许多传统的培养模式，如需要在洁净生物安全柜中进行敞开式操作的工艺，将逐步转为自动化和封闭式的操作模式。各种生物反应器系统，包括摇摆系统，都早已被证实对生产基因改造的T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）有非常积极的作用。这些生物反应器系统支持细胞治疗工业的标准化和规模化。而且，由于用于培养过程的所有阶段的生物反应器系统都是封闭系统，使细胞只包含在一个反应体系中，从而最大限度地降低污染风险和人为的操作失误。

下面我们以Xuri 细胞扩增系统为例，来了解一下如何通过灌流培养来实现T细胞的扩增。

整个过程包括两个阶段激活和扩增。首先，含有一定细胞数的PBMC（peripheral blood mononuclear cells）经复苏后，在T225方瓶中进行激活，并维持一定的密度。

培养至第五天，方瓶中的细胞转移至2 L Xuri Cellbag™一次性生物培养袋中，并在Xuri Cell Expansion System W25系统中进行细胞扩增。期间，在总细胞培养体积达到工作体积1L之前，维持0.5e6 cells/ml的细胞密度，并在细胞密度达到2e6 cells/ml时，进行连续灌流培养。

从结果来看，灌流培养模式更利于T细胞密度的扩增，尤其体现在培养后期，细胞活性和密度都较非灌流模式有显著提高。另一方面，代谢副产物浓度的累积也较非灌流模式有显著降低，这也是灌流培养的一大优势。当然，在可操作的灌流速率下，调整合适灌流速率，同样能维持关键营养物浓度保持在一定的水平，以确保细胞的正常生长。

我们再来看一下另外一个例子，在这个实例中，大家能看到激活和扩增同时都在Xuri 细胞扩增系统中进行的情况。

含有一定细胞数的PBMC (peripheral blood mononuclear cells) 从健康的捐献者体内分离后，在50 ml Falcon™管中37℃静置2小时，进行激活前的孵育。之后细胞接种至2 L Xuri CellbagTM一次性生物培养袋中，并在Xuri Cell Expansion System W25系统中进行细胞的激活和扩增。在整个阶段的前10天，分别进行两次激活，在此期间，通过设置较小的摆角和摇摆速率，来实现半静态的培养模式。从第10天开始，逐步提高培养体积至工作体积1L，并开始进行连续灌流培养，期间根据细胞密度逐步提高摆角和摇摆速率，以及灌流速率。

从结果来看，尽管观察到供体相关的生长变异，但是当T细胞进入其扩增期时再次刺激后，所有供体均发生细胞增殖的总体增加。 在整个培养期间评估淋巴细胞群的百分比后发现，T细胞（CD3 +）在所有Xuri系统中扩增，B细胞和NK细胞相应减少。 在供体之间观察到CD8 + / CD4 +比率的差异。 大多数T细胞在培养结束时是效应记忆，没有末端分化的效应细胞的积累。

从上述两个实例中可看出，Xuri 细胞扩增系统非常利于在一个封闭的系统中对T细胞进行培养，能确保细胞治疗工艺有一定的放大性。Xuri平台不需要额外的开口容器，因此也能确保细胞治疗的制造过程具有高度的自动化和规模化，不受环境和人为因素的影响。

Xuri摇摆平台的灵活性允许以低摇摆速率和角度刺激细胞（半静态阶段）和增加的摇摆率和摆角（摇摆阶段）支持高密度细胞的扩增，使用半静态方法，Xuri 细胞扩增系统不仅支持AST（antigen-specific T cells）的产生，也可应用于其他需要延长静态培养阶段的细胞培养过程。