文献参考：Protein Analysis byShotgun/Bottom-up Proteomics. Chem Rev. 2013; 113(4): 2343-94.
小编终于可以说：“终于完稿啦！”先给小编三秒钟，因为内心狂吼ing……。在这里首先要非常感谢我们的编译MM，辛苦了！也要谢谢各位看官对我们的支持！
秉承对作者的尊敬，下面这段话还是要再赘述一遍。
本篇文献发表于Chem Rev. （IF=45.661）。作者详细总结了目前最最流行的基于质谱的蛋白质组学技术，以及在临床中的应用。
本次文献导读由于篇幅较长，将分2-3部分为各位看官奉上。
近年来，Bottom-up蛋白质组学（Shotgun proteomics）已经被广泛地应用在生物学研究的各个领域。本篇综述分别从蛋白质组学策略简介、蛋白质组学技术（蛋白质提取与分离；高丰度蛋白质处理；蛋白质酶解方法；蛋白质分离与分级方法；肽段离子化、分离及分级方法；以及质谱分析）、基于质谱的PTM（翻译后修饰：磷酸化、泛素化、糖基化）分析、定量蛋白质组学分析（相对定量和绝对定量）、生物信息分析、以及临床应用。
定量蛋白质组学分析
蛋白质丰度的改变是生物学过程或者疾病状态的主要反应；蛋白质水平的改变可以作为潜在的药物靶标，或者疾病诊断的潜在标志物；因此，蛋白质表达以及PTMs的定量分析成为目前蛋白质组学研究的重要组成部分。
传统的蛋白质组学定量方法是双向电泳；但是双向具有较多的局限，如灵敏度较低，鉴定数量相对较少，不适于分析低丰度蛋白质以及一些极端理化性质的蛋白质等。由于双向电泳的局限性，基于质谱的蛋白质组学成为目前最主流的定量蛋白质组学方法。定量蛋白质组学的主要方法如下图所示。
Figure 6. Categorization of the mainstrategies for quantitative proteomics.
（详细注解可见文献内，此处省略一万字………………）
基于质谱的蛋白质组学技术主要包括稳定同位素标记和labelfree两大类。Label free蛋白质组学技术是将样品分别进行质谱分析，通过比较肽段质谱离子强度或匹配到的图谱数目进行相对定量；同位素标记方法则可以将多个样本在不同的实验过程中进行混合，其相对或绝对定量依赖于不同的同位素峰强度，主要包括两种定量方法，一种是计算肽段母离子MS1的丰度，另一种则是计算MS2中同位素报告离子强度。常见的同位素标记方法见下表。
1. 相对定量
(1) 基于MS1定量的稳定同位素标记方法：化学反应标记（ICAT，ICPL，dimethyl），18O标记，代谢标记（SILAC及SILAM）；
(2) 基于MS1定量的稳定同位素标记方法：ITRAQ和TMT；
(3) 非标记定量Label free。
2. 绝对定量
目前，绝对定量主要依赖于已知浓度的稳定同位素标记的标准品，相当于同位素稀释分析；同位素标记的肽段主要来源于三种途径：化学合成稳定同位素标记的肽段（AQUA）， 生物合成定量串联体肽段（QconCAT）以及同位素标记蛋白质标准品（PSAQ）。除同位素标记的标准品外，还有一种方法具有潜在的应用价值，即合成非同位素标记的肽段，用同位素标记试剂如iTRAQ或18Owater。
3. 多重比较
蛋白质组学在进行多组比较时采用的统计学方法与基因组学和转录组学相似，主要包括ANOVA t test，以及Bonferroni，Benjamini-Hochberg，Storey-Tibshirani和Bayes多重检验校正等。这些统计学分析有助于筛选出显著差异的蛋白质用于后期生物学验证。
生物信息学分析
生物信息学分析是蛋白质组学非常重要的组成部分，shotgun蛋白质组学的常规生物信息学分析流程如下图所示。
Fig.10 Representative LC-MS/MS data and a generalized bioinformatics analysispipeline for protein identification and quantification in shotgun proteomics.
（详细注解可见文献内，此处省略一万字………………）
n 应用
1. 蛋白质互作以及蛋白质复合物
研究蛋白质与蛋白质相互作用的经典方法为酵母双杂交（Y2H），其主要局限性在于蛋白质的相互作用不是在生理状态下进行的，并且只能用于分析两个蛋白质之间的直接相互作用，而忽略了间接相互作用。
除Y2H外，亲和纯化结合质谱（AP-MS）分析也是目前主流的用于分析蛋白质相互作用的技术方法；AP-MS可以同时鉴定直接和间接互作，同时可以获得PTM的信息，具体流程如下图所示。
Figure 11.The protein-protein interaction detected by Y2H and AP-MS.
（详细注解可见文献内，此处省略一万字………………）
AP-MS依赖于高质量的抗体，在没有抗体的情况下，串联亲和纯化（TAP）也常用于互作分析，能够有效地减少非特异性结合，具体流程如下图所示。
Figure 12. Schemeof tandem affinity purification (TAP).
（详细注解可见文献内，此处省略一万字………………）
2. 差异比较分析
差异比较分析是蛋白质组学最经典的应用思路，通过比较正常和处理情况下蛋白质丰度以及PTM的差异，寻找与处理相关的蛋白质及其参与的生物学过程。
3. PTM分析
翻译后修饰调控包括磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化和甲基化等，是信号调控网络的一种主要机制。基于抗体的WB是研究PTM的传统工具，但存在抗体交叉反应以及缺少特定PTM motif的抗体等局限；利用MS进行PTM研究成为主流的趋势。
4. 蛋白质周转
蛋白质的表达水平取决于蛋白质的合成和降解速率，而蛋白质的丰度和修饰程度都是高度动态并受到严格调控的，质谱与稳定同位素标记结合是研究蛋白质周转的有力工具，如下图所示。
Figure 13.(a-d) The protein turnover measured by 15N partial labeling with the software ProTurnyzer.
（详细注解可见文献内，此处省略一万字………………）
5. 临床应用
基于质谱的蛋白质组学已经成为临床研究不可或缺的工具，蛋白质组学在临床研究中的主要应用在于筛选疾病特异的生物学标志物，这将有助于疾病的早期诊断及治疗方案的优化；生物学标志物的研发流程详见下图。
Figure 14.Steps of biomarker development.
展望
基于质谱的蛋白质组学技术已经成为生物学研究的重要工具，对蛋白质表达水平和PTM的大规模研究将有助于我们对生物调控网络中所有的蛋白质有一个系统的认识；质谱技术作为传统生物化学和分子生物学技术的补充手段，必将在生物学研究中发挥重要的作用。
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