蛋白质组学样本自身的复杂性(蛋白丰度的动态范围>106, 图2)使得低丰度蛋白鉴定异常困难;
图2. 完整蛋白质组的复杂特性
方案一:timsTOF Pro + nanoElute LC 高通量蛋白组学先驱
布鲁克nanoElute LC为timsTOF Pro质谱标配的纳升流液相,布鲁克应用专家在此平台上,开发了短梯度色谱方法(图3A),此方法28.8min一个循环,连续30针HeLa进样,单针进样200ng的HeLa平均可以鉴定4180种蛋白质(图3B),26000条多肽(图3C),30针重复的相关系数R>0.97(图3D),这些结果表明,此方法与timsTOF Pro的高扫描速度和灵敏度结合,能同时兼顾分析通量和蛋白覆盖深度。我们将此方法用于多组份样本分析,小于12小时即可完成24个组份分析(图3E),HeLa样本24个组份可以鉴定大于9000种蛋白质,小鼠小脑样本24个组份可以鉴定大于10000种蛋白质。
图3. 基于nanoElute短梯度高通量方案
同时,布鲁克还与Evosep公司合作,联合推出用于临床蛋白质组学研究的整体解决方案,timsTOF Pro出色的扫描速度和灵敏度与Evosep One LC强大的分离能力和稳定性完美适配。借助此方案,5min的色谱梯度,单针200ng进样可以鉴定到1400种蛋白质(图4D),7000条肽段(图4E)。
timsTOF Pro与Evosep One高通量蛋白组学平台,得到了英国牛津大学纳菲尔德医学系蛋白质组学项目负责人Roman Ficher博士的青睐,他正在采用这套系统进行血液蛋白组研究,用于快速发现疾病标志物,他们最近的结果显示出了这套系统用于临床大队列研究极佳的性能。他们在研究中将收集的192例血浆样本去除12个高丰度蛋白后,酶切肽段在timsTOF Pro与Evosep液相平台上使用11.5分钟梯度(对应每天近100例样品的分析)分析,样本测试中插入20针QC样本进行质控,总计212个样本仅需51小时即可全部完成测试(图5A),这项工作采用传统的质谱方案可能需要接近10天的时间。实验结果显示,采用4D Match Between Runs进行计算,192个样本中,可以对500个蛋白进行定量分析,并且CV值小于10%, 而QC样本的CV值小于5%(图5B)。
图5. Roman Fischer博士血液蛋白组研究案例
不管是采用布鲁克的nanoElute LC方案还是Evosep公司的Evosep One LC方案,都能极大提高蛋白组学的分析通量。在提高分析通量的同时,研究人员最为关注的就是仪器的稳定性。仪器抗污染能力和重复性则是其是否适用于临床大队列研究的另一重要评判标准,频繁的仪器清洗不仅会影响项目的进展,消耗机时,而且仪器清洗前后定量分析的一致性也存在疑问。
通过连续运行96个HeLa样本(图6),仪器体现出非常好的重现性和稳定性,第1针进样和第96针样,Pearson Correlation为0.97,同时选取7个不同丰度蛋白质来评价仪器的稳定性,可以看到连续96针进样下7个蛋白的强度没有明显变化。
图6. timsTOF Pro稳定性和重复性评估
综上所述,timsTOF Pro带来的采集速度与灵敏度的同时提升,使得其在短梯度下也能实现蛋白深度覆盖,结合其在大队列样本分析中展现出的卓越稳定性,相信基于4D质谱平台开发的高通量和高灵敏度临床蛋白组学方法,必将在生物医学基础研究和临床诊断中有着广阔的应用前景。
参考文献:
Marco Y. Hein, et al., Proteomic Analysis of Cellular Systems, Chapter 1, Handbook of SystemsBiology, 2013
Thomas Kosinski, et al., Short nanoLC gradients optimize throughput on a timss equipped QTOF with PASEF, ASMS 2019, TP 514.