一次性生物反应袋(SUBs)，由于启动成本低、使用方便、污染风险较低，且易于工艺放大，代表了生物制药生产中的一个重要改进，在新工艺开发和中试规模生产中有广泛的应用。但同时也面临新的挑战：潜在的有毒或抑制性物质可能会从SUBs中滤出，进入工艺流体(如含有细胞的培养基)，即提取液和可浸出物(E&Ls)。这些物质会导致细胞生长抑制、昂贵细胞株的丢失和产量的降低等问题出现，可浸出物进入药品的风险已成为实施一次性技术的主要关注点之一。
双(2,4-二叔丁基苯基)磷酸盐(bDtBPP)是一次性反应袋中抗氧化稳定剂三(2,4-二叔丁基苯基)亚磷酸(TBPP)的降解剂，是第一种被鉴定为来自SUBs的可浸出化合物，即使浓度低于百万分之几的水平，对哺乳动物细胞仍有剧毒。对于某些CHO细胞系，当浸出的bDtBPP的浓度大于0.1 mg/L时，就能显著降低细胞密度和细胞活率；用含有bDtBPP的培养液连续传代培养细胞，细胞会表现得很敏感。考虑到添加剂的相关风险，迫切需要了解这些物质对生物过程的潜在影响。
一次性生物反应袋中添加剂的用量很少(一般在0.1%到1%之间），意味着浸出物通常会以痕量的水平存在。因此，有必要发展具有高度选择性、敏感性和特异性的方法来鉴别和阐明化合物的结构，以评估其对细胞的潜在影响。测定细胞培养基中浸出物的另一个考虑因素是基质的复杂性，需要对细胞培养基中可能导致质谱中离子抑制的表面活性剂和其他基质成分进行预检测和消除。
爱尔兰国家生物工艺研究培训所（NIBRT）和都柏林大学的科学家们利用分散液-液微萃取(DLLME)和UPLC-MS技术，克服了检测物浓度低、复杂基质效应等方法开发的挑战，建立了一种快速、灵敏、可靠的鉴定和定量细胞培养基中可浸出物的方法，为测定各种添加剂和降解产物提供了一种简单、快速的替代方法，是E&L评价所必需的。
图1：DLLME-UPLC-MS流程概览
科学家团队还根据FDA生物分析方法验证指南中描述的方法，对所建立的分析方法进行了线性、选择性、灵敏度和准确性(真实性和精密度)方面的验证。为了建立线性关系，还对测定系数(R2)进行了评估，R2的实验值在99.76到99.99%之间，表明在评估的浓度范围内具有良好的线性关系。采用LC-MS对空白样品和加标空白样品进行分析，确定选择性。分析物在萃取得到的离子色谱图中的保留时间没有被观察到干扰，表明LC-MS条件保证了方法的高选择性。实验测定的定量限范围为9.1 ~ 46.3 ng•mL−1。
图2：培养基样品中靶向化合物的UPLC-MS提取图谱
将优化后的方法应用于不同供应商的7个SUBs的分析，所有袋子中均未检测到亚磷酸酯抗氧剂Irgafos 168®。证据表明，由于高温暴露导致氧化， Irgafos 168®可能在孵育步骤中降解。Irgafos 168®主要通过氧化产生氧化形式TBBP-ox，较少情况下，通过水解产生DtBP。在所有样品和两种评价介质中均发现了相似浓度水平的TBPP-ox和DtBP。介质(I)中TBPP-ox的浓度(平均23.3 ng•cm−2)高于介质(II)中的浓度(平均14.7 ng•cm−2)，表明介质(I)有利于该化合物从SUBs中浸出。两种培养基中DtBP浓度相似。
7个分析的SUBs中有6个检测到bDtBPP，其浓度较其它降解产物低，范围为5.6 ~ 26.7 ng•cm−2。然而，只有3个样品在两种介质中检出该化合物，其它3个样品中仅在介质(II)检出该化合物。数据表明，介质(II)有利于化合物的浸出。样品B5和B7显示bDtBPP在两种培养基中的浓度最高，这与观察到的这些袋子的细胞生长性能较差有关，而不考虑其它降解产物的存在。
图3：培养基一次性反应袋中的目标浸出物浓度
建立了DLLME - UHPLC- MS快速、灵敏、可靠的E&L化合物非靶向鉴别和定量方法，特别侧重于Irgafos168®降解产物的测定。通过与标准库和标准品的色谱性能、质谱数据的比较，对添加剂进行了鉴别。研究了添加剂的完全碎裂模式，并用于获得有关结构的信息。开发的DLLME程序使目标分析物在ng•mL−1水平的测定成为可能。该方法经成功验证，定量限低(9.1 ~ 46.3 ng•mL−1)，提取回收率高(82 ~ 109%)，精密度好，同时显著减少了培养基中表面活性剂成分对基质的影响。该方法可用于非靶向浸出物的筛查，也可用于Irgafos 168®在培养基中降解产物的定量。
图4：UNIFI科学信息系统 E&L解决方案
✔ 强大的扩展性：一台QTof可以搭配GC、LC、SFC多种分离技术，实现从极性到非极性E&L物质的发现和鉴别。
✔ 创新APGC软电离技术：打破传统GC/MS鉴定未知化合物对于NIST谱库的过分依赖。
✔ UNIFI科学数据管理系统：包含系统测试、数据采集、数据处理、结果查看和确证、报告的一体化向导式E&L工作流程设计（可自定义工作流程）。
✔ 支持在线或本地数据库：材料添加剂谱库（含保留时间、精确分子量、碎片结构等信息）。
✔ 定性与定量工作的灵活转换
✔ 全面支持数据合规性要求：ORACLE数据库，用户登录及权限分配，多层面详细的审计追踪，支持3Q及计算机验证等。
号外！
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参考文献：
N. Dorival-García, Bones J . Monitoring leachables from single-use bioreactor bags for mammalian cell culture by dispersive liquid-liquid microextraction followed by ultra high performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2017.
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