【前沿】长片段PCR扩增技术新方法

TIANGEN

2022.1.12

PCR

技术

是一项最基本的分子生物学技术，在分子生物学、生物技术、合成生物学、诊断、检测、鉴定和法医分析等领域受到广泛地应用。其中长片段PCR主要应用在大片段基因功能研究、多基因簇研究，基因组结构变异分析、大片段合成（比如染色体合成）、高通量测序等多方面。

长片段PCR往往由于模板的复杂性而存在扩增壁垒，已经有一系列技术策略发表来应对长片段难以扩增的问题，比如采用Taq和Pfu的混合酶、或者开发出性能更强的热稳定高保真酶，优化反应体系组成、缩短变性时间、增加退火温度、延长链延伸时间等。不过能够稳定地扩增10kb以上的复杂基因组片段（尤其是植物基因组）仍然存在挑战。

最近，华南农业大学刘耀光院士和陈乐天教授团队，在Molecular Plant在线发表了题为STI PCR: an efficient method for amplification and de novo synthesis of long DNA sequences的研究论文。该研究开发了一种新的扩增超大片段和体外大片段DNA合成的方法，称为抑制热交错PCR（Suppression Thermo-Interlaced PCR, STI PCR）。

该方法基于两种策略

1. 长片段扩增时经常会产生较短的非特异扩增，短的非特异扩增与长的目标产物相比具有更强的扩增能力从而抑制了长片段扩增。基于这个问题，作者设计了PS(PCR suppression)引物，在正反向特异引物的5’端增加了相同的arbitrary GC-rich序列（20-25 nt，该序列Tm值略高于基因特异结合序列）(图1. A)，从而在退火延伸阶段，短的变性非特异产物容易形成稳定的茎环结构从而抑制了后续自身的扩增，而大片段不容易形成茎环结构，不受抑制，保证了高效扩增（图1. B, 2A, C）。

2. 复杂的基因组往往GC含量分布不均匀，高的退火延伸温度更有利于高GC区的延伸合成，而在此温度下，低GC区的碱基配对往往是不稳定的，因此会降低链合成效率。基于这个问题，如果采用Nested thermo-interlaced cycling (TIC)策略，采用变温循环延伸，高GC和低GC区都能得到高效延伸，效果会比常规PCR扩增更好（图1. C, 2A, B）。

图1 STI PCR工作示意图（来自文献）

A. 典型的PS（PCR suppresion）引物组成，正反向引物5’端含有相同的arbitrary GC-rich序列（20-25 nt）。

B. 在PS的退火延伸阶段，短的变性非特异产物容易形成稳定的茎环结构从而抑制了后续自身的扩增；而大片段不容易形成茎环结构，保证了高效扩增。

C. STI PCR反应程序示意图。super-cycle代表N (35-40)个变性退火延伸的步骤；Nested TIC（thermo-interlaced cycling）代表每个super-cycle的退火延伸阶段，由n个循环的stepwise-或者ramping-温度改变组成，n跟片段大小有关。

当两种策略结合起来，长片段扩增能够达到比单种策略更加特异的高效扩增结果（图2. A-E）。另外对于一些特别长的基因组DNA片段（比如> ~30 kb），可以采用两轮STI PCR得到更好的扩增（图2. F）。

图2. STI PCR实现了超长基因组DNA片段

的特异扩增（来自文献）

A. 采用常规的引物和反应条件扩增一些水稻基因组长片段。

B. 采用常规的引物和nested TIC扩增A中的片段。

C. 采用PS引物和常规PCR反应条件扩增A中的片段。

D. STI PCR（PS引物和nested TIC）扩增A中的片段，扩增特异高效。

E. 一轮STI PCR扩增超长基因组DNA片段。

F. 对于一些特别长的基因组DNA片段（比如> ~30 kb），可以在STI PCR扩增一轮产物之后，再用巢式PCR的方法（引物无需PS，反应条件仍旧nested TIC）扩增第二轮。

为了方便研究者更有效地利用这项技术，作者特别开发了基于网页的calGC工具，研究者提交目的序列后，系统会自动分析该序列的GC分布，并且给出PCR反应的最优程序建议。另外作者也分析了STI PCR的影响因素，并且给出该技术在大片段DNA从头合成中的应用事例，感兴趣的老师可以阅读文献了解详情。

参考文献：

Zhao Z., Xie X., Liu W., Huang J., Tan J., Yu H., Zong W., Tang J., Zhao Y., Xue Y., Chu Z., Chen L., and Liu Y.-G. (2022). STI PCR: an efficient method for amplification and de novo synthesis of long DNA sequences. Mol. Plant.

doi: https://doi.org/10.1016/j.molp.2021.12.018.

STI PCR这项技术增强了大片段扩增的可能性，对于研究者来说真的是yyds。不过我们也看到，这项技术的核心是通过优化引物（PS引物）和扩增策略（nested TIC）来实现的。对于长片段扩增来说，DNA聚合酶也同样发挥举足轻重作用。扩增长片段或者是增加PCR循环后会有序列保真性降低的风险，碱基产生替换或者插入缺失突变都有可能会影响后续的基因功能分析或测序结果。因此在长片段扩增时，选择一款保真性强并且扩增效率高的酶，是需要重点考虑的事情。

超强高保真酶PCR试剂盒II

（目录号：KP213）

保真性达到Taq DNA聚合酶的180倍

在普适性、延伸力、灵敏度方面也表现优异

高保真性：为Taq DNA聚合酶的180倍。
模板普适性：能够识别GC含量30%~80%的不同物种DNA片段。
延伸力强：可扩增长至20 kb的DNA片段。
高灵敏度：基因组模板用量可低至1 ng。
操作简便：只需加入模板和引物，轻松配好体系，PCR产物平末端，纯化后可直接用于无缝克隆。

不同的酶保真性比较

使用二代测序法检测酶的保真性，TIANGEN KP213保真性可达Taq酶的180倍。

普适性比较

使用不同高保真酶分别扩增不同来源、不同长度的片段。结果显示，KP213在扩增能力、特异性、普适性、长片段扩增效率方面的综合性能表现优秀。

A: TIANGEN KP213; B: TY 公司高保真酶；C: K 公司高保真酶。模板上样量: 基因组DNA, 200 ng; λ DNA, 50 ng。

M: TIANGEN D15000 Marker。1: 0.75 kb; 2: 1 kb; 3: 2 kb; 4: 3.9 kb; 5: 6 kb; 6: 0.48 kb (GC 75%); 7: 1.5 kb (GC 71%); 8: 2 kb; 9: 8.2 kb; 10: 2.3 kb; 11: 2 kb; 12: 3 kb; 13: 8.2 kb; 14: 8.1 kb; 15: 15 kb。

高低GC模板适应性