这个讲座来自于Merck的色谱专家Imad Haidar Ahmad 和Erik Regalado，主要介绍了通过建立色谱模型，使用多因素色谱峰跨越（MPC）技术交换目标峰位置如何提高分析型色谱的分离度，同时将方法放大到制备型色谱提高上样量缩短制备时间提高效率的一些应用案例。这种技术已经广泛应用在Merck内部的分析型和制备型色谱方法开发，并且Merck在色谱分析杂志上发表过该相技术的相关论文。[Journal of Chromatography A,1587,129-135]
Merck开发色谱方法的策略如上图所示，首先会进行色谱柱和流动相（pH）的筛选，从色谱分离度方程上看选择性a对分离来讲是一个重要的参数，所以选择一个合适的色谱柱和流动相（pH）对色谱建模来说将会是一个较好的起点。下一个阶段是完成3*3（梯度*温度）9点实验作为建模的预实验。再将实验数据带入ACD/LC Simulator建立模型得到色谱分离度图，再在分离度图上找寻合适的色谱方法。左侧为典型的两因素模型分离度图，通常纵坐标为温度，横坐标为运行时间或有机相比例%B，分离度图上蓝色表示分离度较差的方法区域，橙色表示分离度较佳的方法区域，因此最终的色谱方法将会在橙色区域中选择。同时开发好的分析型色谱方法都将存入色谱方法数据库中，这对以后的同类型样品的分析型和制备型色谱方法的开发将会大有益处。
下面个例子就是用来说明这种开发色谱方法策略的好处。这是一个20种核苷酸分析分离方法开发的例子，显然如果没有色谱模型模拟想开发好这样的色谱方法就比较困难。通过设计一个3*3（梯度*温度）9个实验建立模型，得到左侧的分离度图，图上的橙色区域为分离度区域较好的方法区域，再在橙色区域中选择合适的方法。下图为分析型实验色谱图与模型预测谱图的叠加图，从叠加图上看出实验谱图与预测谱图吻合度较好，大部分色谱峰保留时间偏差都很小。这样就建立的这一类型核苷酸样品的分析型色谱标准方法，这对于以后再次开发核苷酸类样品色谱方法来说，这个方法不失为一个很好的起点，因为实际项目中可能只会存在一部分目标组分，所以可以在这个色谱模型中去除那些不感兴趣的峰，然后再选择合适的色谱方法，这样就能很快找到了新的分析方法，这就是建立色谱数据库对分析型色谱方法开发带来的好处。
这一方法开发策略对于制备型色谱方法开发可以带来什么样的指导意义呢？首先需要回答一个问题：对于制备型色谱方法而言，什么方法才是一个好的方法呢？好的制备型色谱方法需要具备以下三个特点：
1，较快制备色谱方法周期，也就是较短的色谱方法时间；
2，目标峰与相邻的峰之间有较好的分离度；
3，目标峰的上样量要大。
还是这个20个核苷酸的例子，假如只需要分离第12号峰，在同样的色谱模型中我们将12号峰设定为“相关”峰（relevant peak）其余的峰设定为“非相关”峰（irrelevant peak），模型计算分离度时只考虑第12号峰于相邻峰的分离度，忽略其余峰之间的分离度，这样可以得到新的分离度图，再在新的分离度图中选择合适的制备色谱方法。从这个例子可以看到，我们不仅可以得到较好的目标峰分离度，这个带来的好处是在可以提高20倍的上样量，同时由于只关心特定的色谱峰，从而可以尽量缩短色谱运行时间，这个例子中运行时间可以从分析型色谱的80分钟缩短到制备型色谱的27分钟，提高3倍效率，这样整体效率提高60倍。
这是一个具体应用的场景，同样还是核苷酸类样品，一共有10个组分，2号峰为目标组分，需要分离后进行目标峰定性。当前分析方法存在的问题是1号峰对2号峰形成了干扰，为了能有好的分离度，当前方法的色谱进样量限制在5uL。重新开发方法是通过建立色谱模型，选择合适的色谱方法使得目标峰与其余峰之间有了很大的分离度空间，从当前分析型色谱图上就可以看出此方法有很大的上样量空间，实际工作中上样量由5uL提高到500uL分离度也能有很好的保证，同时色谱运行时间由原来的80分钟缩短到40分钟，这样的制备型色谱方法整体效率提高了200倍，相对于原始方法而言可以更快更早地制备出足够量的的样品用以定性，加快项目进度。
这里总结一下Merck是如何使用模拟技术贯穿整个分析型制备型色谱方法开发的全过程。在分析型色谱方法开发阶段，筛选合适的色谱柱，合适的流动相，建立色谱模型得到分离度图选择合适的分析方法；下一阶段到了制备型色谱方法开发阶段，使用色谱模型重新针对目标峰进行方法优化，得到适合放大的方法然后再应用到制备色谱上，这样可以大大提高工作效率。
一般来讲上述的策略都非常奏效，但是在有些项目上可能会有问题。例如，在这个环状低聚糖分离的项目上遇到了新的挑战，目标峰为14号峰位于两峰之间，他们的结构都很接近，所以很难将14号峰从两峰之间分离出来，这样的项目就需要使用MPC技术。为了更好的理解MPC技术，首先需要理解分离度图上的蓝色带（blue stripe），在分离度图上蓝色带表示系统中存在两个组分没有分离度，但是两个橙色区域之间的蓝色带又意味着什么？为了理解这个问题需要下面的例子来协助更好的理解什么是MPC。
此例子中两片橙色的区域中间隔着一个蓝色带，分离度图的纵坐标为温度，图上的三个点分别代表三个色谱方法，温度依次从低到高。观察中间蓝色区域的点的色谱图可以发现2，6号峰共流出，蓝色上下两橙色区域意味着如果跨越此蓝色区域当温度从低到高变化时，2，6两个峰的运动轨迹是彼此相互靠近，共流出，然后向相反的方向原离，再仔细观察两橙色区域的色谱图发现2，6两峰位置发生了颠倒，这就是MPC技术。这种峰跨越现象并不是新发现，但是利用这种现象使用色谱模型来指导色谱方法开发Merck属于首创。
这张分离度图可以让大家更好的理解MPC技术中“多因素”的概念，这张分离度图纵坐标为温度，横坐标为有机相比例%B，分离度图上存在很多橙色区域，当选择方法的点水平从A点移动到D点，改变的是方法的有机相比例%B，这个变化跨越了多个橙色区域，比较A，B两点的色谱图发现，3，4号峰的洗脱顺序发生了颠倒；当温度沿着垂直方向由D变化到F时，也会跨越多个橙色区域放生了谱峰跨越现象；当从A点对角线变化到F点，或从F点对角线变化到A点，此时同时改变了两个因素温度和有机相比例%B这就是所谓的的多因素协同变化。比较A点和F点色谱图发现，3，7号峰的洗脱顺序发生了很大的变化，换句话来讲就是，3，7号峰与其它峰之间发生了峰的跨越，实现了峰位置的交换。
如何才能发现这些峰的跨越现象，找到这些峰跨越区域。这里有两个需要注意的地方可以帮助大家更好地发现这一现象。一是对于等度洗脱模型来说分离度图的展示只有两个因素，一个是纵坐标温度一个是横坐标等度有机相比例B%，所以分离度只有一张；但是对于梯度洗脱模型来讲在横坐标梯度变化上会有三个因素可以考察，一个是梯度起始点的有机相比例，梯度时间和梯度终点的有机相比例，对应会有三张分离度图，所以在具体项目上要选择合理的分离度图。二是在平常的分离度图上橙色区域不是太明显，正常的色温显示分离度>1.5的区域与蓝色区域颜色区分度不大很难以察觉，这里就需要让这些区域的颜色过饱和化，具体方法是调整分离度色温等温线将分离度大于1.5的区域都调整为橙色，这样谱峰跨域区域颜色会更明显。
再回到上面的环状低聚糖分离的项目，原先方法的问题在于14号峰在13，15号峰的中间，如果想提高样品的上样量，可能造成的后果就是14号会被13，15号峰盖住。但建立色谱模型找到峰穿越区域，调整有机相比例后的色谱方法将13号峰放到最后，这样在同等条件下（柱子内径一致）上样量就可以提高20倍，给与制备型色谱方法提供了很大的上样量空间，提高工作效率。
在这个免疫抑制药的项目中，原始方法为色谱图A，目标峰紧跟着另一个峰分离度较差，原始方法的温度大概在75度，使用这样的色谱方法分离出目标物质的难度较大，但是当建立色谱模型后，发现了另外两个区域目标物质有分离的趋势，当然峰的洗脱顺序也发生了变化，在B区域也就是温度降到50度左右，目标峰与原先共流出的峰发生了分离，但是与后面的峰位置较接近分离度空间不大，继续将温度降到15度附近后，发现目标峰发生了峰跨越现象跨越了原先两个干扰峰的位置，在最后面洗脱出来，这样给了制备色谱很大的分离度空间。再做进一步的探索在色谱分离度图上可以看出，如果是改变梯度条件如梯度时间，方法点沿水平方向移动，就不存在这样的峰穿越现象可能就找不到合适的色谱方法。
这是一个离子交换色谱的例子，前面的例子都是如何提高杂质小峰分离度的例子，这个例子是如何提高API分离纯度的例子，从原始的方法色谱图上看，如果想得到好的纯度的API物质就需要消除杂质X的影响，如果想加大进样量杂质X势必会影响API的纯度。为了解决这样的问题，建立色谱模型，优化梯度时间得到了新的色谱方法，新的色谱方法上将原先影响API纯度的杂质X移动到API后出峰，这样即使在柱内径7.5mm的色谱柱上上样量可以提高60倍，同时色谱的运行时间由原先的30min缩短到17min，提高近一倍的效率，整体效率调高了100倍。即使最后放大到大内径的制备色谱柱上（内径21.5mm），分离效果依然有保证，保证了API的纯度。
最后一个例子还是关于核苷酸杂质分析的例子，这是一个关于微量杂质定量方法开发的例子，从原始方法看，需要定量的杂质位于主成分的峰尾上，这样的位置对定量分析来说很不利，因为当目标杂质含量很小时，杂质的峰面积会是一个很大的问题。当建立色谱模型优化梯度时间后发现B区域的色谱图将目标杂质的位置移动到一个比较合适的位置与周围的峰有较大的分离度，虽然这时候其它有些峰之间的分离度不是很好，但是此方法的主要目标是目标杂质的分离度。目标峰位置移动到新区域带来的好处可以从方法的线性图上清楚地看出来，黑色的点是新方法的趋势线，相比于老方法红色点的相关性更好，另外在低浓度区域老的方法可能会有很大的问题，新方法的检测限定量限会更好，从S/N列表中也可以清晰的看出黑色方法的S/N会更好，定量会更准确。
最后总结一下，应用计算机辅助方法开发使得Merck的色谱方法开发工作做到以下几点：
1, 开发出分析方法Robust更好
2, 建立相关物质方法数据库，使得对于类似物质分析型和制备型色谱方法开发工作更加方便
3, 开发出的分析型方法更具放大的可能性
4, 使用色谱模拟谱峰跨越技术（MPC）使分析方法更有效率
5, 使用色谱模拟谱峰跨越技术（MPC）可以针对一些低浓度杂质的开发出更好的分析方法。
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