01
背景介绍
ACD/Labs
自主研发的改良型新药制剂KEM2112有关物质分析方法在开发阶段参考EP收载的原料药有关物质检测方法（见表1）进行检测，系统适用性满足要求。但在后续样品检测过程中，发现系统适用性溶液中API与相邻杂质B的分离度不稳定，在1.45~2.60之间变化，存在较大风险（见图1）。通过排查不同种类稀释剂或色谱柱，均未找到引起分离度变化的根本原因。
表1.药典方法
图1.药典方法系统适用性溶液色谱图
基于AQbD理念进行分析方法开发，首先应明确分析方法的开发目标（analytical target profile，ATP)，即分析方法需要测量的对象及其要求的水平，分析方法目标决定了分析方法开发的质量和效果。结合原料药在酸和高温条件下的强制降解结果。高温条件下降解杂质主要为杂质B、杂质D及杂质I，酸破坏条件下降解杂质主要为杂质H。故将研究对象定为API、杂质B、杂质D、杂质H、杂质I及原料药本身存在的两个未知杂质（杂质1和杂质2），详见图2。对于KEM2112项目，我们的开发目标为API与杂质B之间的分离度在2.0以上，其他杂质之间的分离度应不小于1.5。同时尽可能缩短分析时间，提高分析工作效率。最终建立分析方法设计空间和操作空间，确保分析方法的稳健性。
图2.原料药强制降解结果
02
方案设计
ACD/Labs
使用ACD软件pH Selection预测API及各已知杂质的LogD曲线如图3所示。从图中可以看出，杂质B、杂质H、杂质I均为中性化合物，没有酸碱基团，其LogD值不随pH变化而发生改变，表现为一条直线，杂质H和杂质I的LogD曲线比较接近。而API与杂质D结构中分别有1个羧基，呈现典型的酸性化合物特征，在低pH条件下呈现分子状态，LogD值在2.5以上，具备较强的疏水性，推测在C18色谱柱上有较强的保留。随着pH值增大，化合物逐渐解离成离子态，LogD值降低至-1.3左右，保留减弱。这表明API及杂质D将因为流动相pH值选择的不同，而出现与色谱柱保留能力强弱的差异。综合分析，当pH在1~6之间，API及各已知杂质的LogD值均在-1之上，普通的C18色谱柱对其应具有较强的保留能力，无须添加离子对试剂。
图3.API及各已知杂质的LogD曲线
根据分离度公式，影响分离度的因素主要包括色谱柱柱效（N），保留因子（k）及选择因子（α）。色谱柱柱效N属于动力学影响因素，主要由色谱柱特性如柱长，色谱柱粒径，流速及压力等因素决定。保留因子k和选择因子α属于热力学影响因素，对分离度的影响更为显著，是我们进行方法优化的重点考察方向。从分离条件对N，k和α的影响程度分析（表2），选择有机相比例（梯度）和流动相pH值两个主要影响因素进行实验设计（前期已经考察过不同有机溶剂如甲醇作为有机溶剂对分离度的影响，无明显改善）。
表2.分离条件对k、α、N的影响
使用正交实验设计（表3）的方式考察流动相pH（2.0、3.0、5.0、7.0）及不同梯度（详见图4）对待测化合物之间分离度的影响。使用ACD软件建模分析，使主峰与杂质B的分离度大于2.0，各降解杂质之间的分离度不小于1.5。
图4.梯度设计
表3.正交实验设计
03
实验过程
ACD/Labs
根据表3设计的正交实验，配制0.05mol/L磷酸二氢铵溶液（pH2.0）、0.05mol/L磷酸二氢铵溶液（pH3.0）、0.05mol/L乙酸铵溶液（pH5.0）、0.05mol/L磷酸氢二钠溶液（pH7.0）缓冲液分别作为流动相A，四氢呋喃作为流动相B。按图4梯度设计建立分析方法，依次进样供试品溶液（含KEM2112原料药0.2mg/ml，各已知杂质含量约为0.2μg/ml），共得到12张色谱图，将实验数据导入ACD软件，根据峰面积及UV光谱对API及6个杂质进行峰标记。杂质D，API，未知杂质1及未知杂质2的出峰时间随pH值变化保留时间有较大的变化，与其他杂质之间产生了相对位置的变化。杂质B，杂质H及杂质I的保留时间没有明显变化（如图5所示）。在不同梯度条件下（固定pH不变），化合物的出峰顺序没有发生变化。
图5.流动相pH对化合物保留时间的影响
选中所有数据进行梯度-pH两因素建模分析（n=12）。发现杂质1，杂质D，API及杂质2的保留时间模型预测值与实测值之间差异较大，杂质B，杂质H及杂质I基本吻合，详见图6。因杂质D及API均为酸性化合物，其保留时间受pH影响较大，推测可能是流动相pH影响导致建模失败。为验证此结论，分别使用pH2.0、3.0、5.0、7.0条件下的3个梯度结果进行梯度单因素建模分析，发现各pH条件下梯度建模准确度良好，基本验证了此前的推测。其后舍弃pH7.0数据，使用pH2.0、3.0、5.0在不同梯度条件下的数据重新导入ACD软件进行建模分析（n=9)。API与各杂质保留时间模型预测值与实测值之间无明显差异，详见图7，说明模型预测准确度良好。
图6.模型预测值与实测值拟合结果（n=12)
图7.模型预测值与实测值拟合结果（n=9)
04
实验结果及结论
ACD/Labs
使用pH和梯度两因素三水平（n=9）的数据进行建模分析，得到分离度图（resolution map）如图8所示。图中不同的颜色代表不同的分离度。图中最右侧标示了不同颜色所对应的分离度值。横坐标表示梯度时间，纵坐标代表pH。从图中的颜色区域划分直接可以看出在不同的pH值和梯度时间组合时的分离度变化，从而有助于选择使方法成立的参数范围。分离度图中所取的点为Rs=3.9（杂质H、杂质I)。对应pH值为4.0，梯度时间为15min（四氢呋喃比例由初始的10%增加到45%）。方法的设计空间范围为pH3.9~4.1，梯度时间在13min ~ 17min范围，均可满足分析方法目标要求，具备一定的耐用性空间。
图8.两因素模型预测分离度图
重现模型预测分析方法。配制0.05mol/L乙酸铵（pH4.0）溶液作为流动相A，四氢呋喃作为流动相B，结果如图9所示。重现ACD建模有关物质方法得到的色谱图与ACD建模预测得到的色谱图基本一致，出峰顺序与模型预测结果完全一致，API与杂质B的分离度为9.90，杂质间最小分离度为3.58（杂质H、杂质I），各杂质之间分离度不小于1.5。符合最初设定的分析方法目标。
图9.重现ACD建模分析方法色谱图
05
讨论
ACD/Labs
在改良型新药的早期研究阶段进行分析方法开发时，当没有药典及文献参考，或参考方法不适用时，要求我们在很短的时间内开发出具备一定的专属性和耐用性的分析方法，若使用传统的单因素（OFAT）方法可能耗费巨大的人力和物力都难以得到令人满意的结果，也很难总结出规律指导今后的方法优化。本研究使用ACD软件进行待测化合物logD值预测，帮助我们更好地理解了化合物之间的结构差异及色谱保留行为的差异。从而有针对性地锁定流动相pH作为方法优化的重要参数加以关注，对pH的考察范围也提供了充分的理论依据。基于AQbD理念对有关物质分析方法进行了优化。定义分析方法目标为提高API与杂质B之间的分离度在2.0以上，其他杂质之间的分离度应不小于1.5，同时缩短分析时间，提高分析工作效率。对影响分离的关键因素进行了全面评估，确定流动相pH及梯度为关键方法参数。应用ACD软件，结合科学合理的实验设计，让我们仅仅通过9针样品的实验数据建模开发了可靠耐用的分析方法并得出了方法设计空间。大大提高了分析方法开发的效率和质量。最后通过实验，进一步验证了模型预测的准确性。更重要的是，通过模型分析，我们可以非常直观地看到当色谱条件发生变化时，不同化合物的保留行为的变化趋势，为将来可能的分析方法优化指明了方向。
但本研究存在问题是关于pH7.0条件下建模失败的原因尚不明确。分析一方面可能是由于在pH7.0条件下使用不同的缓冲盐，色谱柱体系尚未完全平衡好，导致部分化合物的色谱峰保留时间出现偏差，检查图谱也发现pH7.0条件下的部分杂质峰峰形变差；另一方面可能是设计的pH考察范围太宽，产生过度拟合问题。
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