引言
之前我们翻译过一篇Merck的色谱专家 Imad Haidar Ahmad 和 Erik Regalado使用AutoChrom/LC-Simulator计算机辅助方法开发在1D液相色谱上的应用(
与一维液相色谱相比，二维液相色谱(2D-LC)的优势有：
强大的分离与获取样品全面信息的能力
提高隐藏峰的可靠数据
获得高通量的潜力
尽管2D-LC功能强大，但为了发挥2D-LC技术最佳性能，需要色谱研究员具有较强的专业知识。许多色谱工作者认为，目前缺乏高效的2D-LC分离条件优化的系统方法，导致2D-LC无法作为工业应用的主流仪器。Imad Haidar Ahmad 和 Erik Regalado最近研究计算机辅助2D-LC方法开发，他们认为能极大的简化online和offline 2D-LC色谱方法开发的流程。使用LC-Simulator的模拟功能，在最小数量的正交实验下（例如两因素梯度温度优化），通过构建相关药物的分离度图，寻找最佳的分离体条件，系统化2D-LC方法开发的流程，提高工作效率。
内容一
在制药企业中，计算机辅助1D-LC方法开发是比较普遍的。但是，采用直接系统化的方法对2D-LC方法模拟以分离复杂的多组分反应混合物是不常见的。采用2D-LC仪器同时建立手性和非手性方法显得更加的困难。以下将介绍位置异构体和手性异构体的分离。
在药物代谢或后期功能化研究中，经常会遇到需要同时分离包含复杂异构体的样品，这种样品同时包含了位置异构体和手性对映异构体，给开发非手性和手性分离方法带来了挑战。
此篇文献中，Merck的色谱专家分离抗凝药物华法林和和5个羟化异构体，存在一个手性中心，共12种相关结构的物质。
Figure 1
首先在反相1D-LC色谱上采用手性色谱柱(Chiralcel OD-3R)，完成了柱温和梯度2因素正交实验的优化，并在LC-Simulator中构建了Figure1(a)中的分离度图。分离度图中的橙色区域代表12种分析物分离最好时对应的柱温和B%条件。即使在最佳的分离条件下，仍然有些物质共洗脱，Figure1(b)图中的Cluster1(包含4种物质，蓝色)和Cluster2(包含2种物质，绿色)。在使用LC-Simulator优化方法时，可以将Cluster1和Cluster2中共洗脱峰设为“irrelevant”，软件在计算分离度时将不会考虑这些峰对分离度的影响。
仅使用1D-LC色谱完全分离这12种化合物看起来十分困难。他们将在这根色谱柱的1D-LC建模中的数据用于2D-LC方法开发，一旦找到优化的方法便切出Cluster1和Cluseter2,然后online 2D-LC仪器上重现。如Figure2所示，他们发现在当前的色谱柱和流动相体系(0.1%FA water/ 0.1% FA ACN)下，即便是在最佳色谱条件下，Cluster1中的4种物质也不能满足分离要求。
Figure 2
他们在不更换色谱柱的前提下，采用0.1%H3PO4/ACN体系，第二维换流动相，进行方法2D-LC方法开发，色谱图如Figure3所示。即使在最佳条件下，Cluster1中的4个峰分离稍微有所改善，但Cluster2中的2个峰分离变差。
Figure 3
也就是说从优化层面暂时没有办法解决分离。但Cluster1(10-OH-1,10-OH-2,6-OH-1,4-OH-2)以及Cluster2（6-OH-2,8-OH-1）在的确在结构上有明显差异，而且是位置异构为主，此时很可能可以找到合适的色谱柱对这两组化合物有很好的选择性。他们翻看了之前的筛选记录，在之前的研究结果上，更换了色谱柱为Vancoshell（万古霉素固定相手性色谱柱），采用0.1%H3PO4/ACN体系，实现了Cluster1和Cluster2两组峰的基线分离，结果如Figure4图所示。最终，他们采用中心切割技术的online 2D-LC，在LC-Simulator的辅助下，完成了12种化合物的基线分离。
Figure 4
Figure 5
在这里，阎作伟认为作者将色谱柱选择做了一个非常有趣的桥接。用A柱将某些物质聚集在两个cluster内，而选择另外一个对两个Cluster内的物质有选择性的色谱柱方法接入第二维。令人觉得巧妙而且可以学习借鉴。当然前提是作者对手性柱的筛选和优化都做得比较到位，要达到这个目标，Lc-simulator起的作用是追求分离的基线。
内容二 制备
Imad Haidar Ahmad 和 Erik Regalado不仅将计算机辅助建模应用于分析级别的2D-LC方法开发，他们也首次将LC-Simulator用于制备级别的offline 2D-LC方法开发。从Figure6中可以看出，LCAP是需要制备的杂质。从Figure6b中看出，在1D-LC中LCAP与左右峰的刚好分离，如果加大上样品，会导致分离变差。在2D-LC色谱中，针对LCAP与左右干扰峰的分离度进一步优化方法，优化后的方法如图Figure6d所示。1D-LC色谱用于富集含有目标杂质的馏分，2D-LC色谱关注目标杂质与左右峰的分离，让LACP与邻近峰的分离度足够大，在制备分离时可以加大上样量提高收率。最终，经过2D-LC色谱方法的优化，制备分离的LCAP的色谱峰面积达到了99.9%。
Figure 6
要指出的是，计算机辅助实验建模已经从分析水平色谱进入到了用10微米的粒径的制备色谱，用于支持更高效率的杂质制备研究。这篇研究的主要关注点不是传统的上样量优化，而是以整体分离以及最佳分离为目标的策略。多组分的分析分离和制备分离通常具有挑战性，需要使用多维色谱技术。当前，繁琐的方法开发和优化步骤阻碍了2D-LC的广泛使用。在这项工作中提供了示例说明了实用的计算机辅助色谱的使用建模方法（使用可商购的AutoChrom软件），可轻松进行离线和在线优化用于新药分析和纯化的二维液相色谱方法。
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