在上期的课堂上，我们介绍了活细胞成像系统中也是所有显微镜系统中最重要组成部分——物镜以及物镜的重要参数。本期课堂，将介绍所有光学系统中都必不可少的光源。
Lesson Three 照明系统
在活细胞成像中，典型的显微镜照明系统包括一个光源、用于确定曝光时间的光闸以及用于选择光强度和波长的滤色片。活样本照明的目标是产生一个时间恒定，空间均匀的场，在精确的时间内具有特定的光谱特性。
在明场显微观察方式（包括DIC、HMC和相差技术）中，光源包括传统的卤钨灯，也就是我们常说的白炽灯。而荧光显微观察方式则需要更强的照明光，通常由等离子电弧放电灯或扫描激光束提供。使用汞或氙作为蒸气源的等离子电弧灯产生足够的光，可以使用滤光片选择窄带波长作为荧光的激发光。氙灯的输出相对稳定，有宽而平的波长光谱，这两种特性对于定量应用，如强度测量和对比成像，都很重要。相比之下，汞灯强度很高，但随着使用年限的增长会出现闪烁，并且有包含尖峰输出的不规则光谱。新型金属卤化物灯结合了氙灯和汞灯的优点。
上图所示的是三种常用的等离子体电弧放电灯（汞、氙和金属卤化物）的光谱图，以及独立氙灯照明系统。可以看出汞灯和金属卤化物灯之间有相似的光谱峰值，但后者光源显示的相对强度总体较高。相比之下，氙气灯在可见光区域产生相对平坦的光谱，在红外谱线中有几个小峰。图3所示的氙灯照明系统包括一个灯、灯室、冷镜和电源，所有这些都整合在一个装置中，通过液体光导管耦合到显微镜上。此类设备的设计目的是为光学系统提供强烈的照明，并可容纳光闸和/或滤色片转轮灯附件。
针对活细胞成像应用的显微镜的照明系统需要光闸来限制样本暴露在光照下被能量损伤的时间。由机电一体化控制的光闸（如图4（e）所示）可以精确控制曝光时间，是弧光灯光源限制样本光照时间最有利的工具。然而要注意的是，在图像从检测器传输到主机之前，并没有对活细胞进行成像的显微镜系统会不经意地打开快门。对于长期的延时成像实验来说，每次曝光额外0.5秒的光照时间看似微不足道，但可能是灾难性的。
滤光片的主要功能是在光到达样品前调节光的频率（波长或颜色）和/或强度。非激光光源（弧光灯和卤钨灯）的强度应尽可能通过光学密度滤光片减弱，而不是通过调节驱动灯的电源来减弱。光学密度滤光片通常是镀有金属的玻璃或石英片，可以在不显著改变光谱的情况下降低光强度。在明场照明中使用绿色带通滤光片可以通过限制那些校正较差的物镜产生的色差影响来提高分辨率。
为激发光和发射光选择指定带宽而设计的滤光片通常会装在一个滤光片转轮里，或者直接装入一个荧光滤色镜组中（如图4（a）和4（b））。位于激发光谱中的任何单波长或窄波段的光照都会产生横跨整个发射光谱的宽波段荧光波长（这一现象被称为卡沙定律）。因此，强烈建议在活细胞成像中使用窄的（约10至20纳米）带通激发滤色片，以最小化背景自发荧光。通常，显微镜制造商和供应商提供的预安装滤光片组包含的都是宽带通的激发滤色片，这会增加背景荧光并对样品引入过多的有害光照。在大多数情况下，窄带宽将有助于充分激发荧光蛋白和合成荧光团，同时限制光毒性。然而，当目标丰度较低或使用非常暗的荧光团时，较大带通的激发和发射滤色片会有助于改善信噪比。
在尝试提高成像系统的信噪比时，为选择发射带宽而引入的吸收滤色片和二向色镜的组合经常会被忽略。二向色镜只需要在激发（反射）和发射（透射）滤色片间进行锐利的切换。此外，二向色镜还应该在激发波段有最大反射，以及将发射光谱区域中的透过衰减降至最低，并传递给吸收滤色片。选择发射滤色片的参数（带宽和光谱）时，滤色片的带通应与目标荧光团的发射光谱曲线紧密匹配，以使信号最大化。
包含多个带通的专用滤色镜组可用于同时对两个、三个或四个荧光团成像。但是，除非这样的滤色镜组是用在彩色数码相机成像的多色应用中，否则他们在信噪比，透过率，和其他伪影方面不如用单色检测器成像的针对单个荧光团的滤色镜组。一个更好的选择是在电动滤色片转轮（图4（d））中安装单带通滤色片用来过滤激发和发射光，而在显微镜的荧光滤色镜转轮（图4（b））中保留多带通二向色镜。在双色或三色成像中，使用单带通滤色片获得信号增加是一个折衷方案，它增加了图像失准和独立平场校正的可能性。
图4中所示的是一些可用于荧光显微镜波长选择的设备，以及常用于活细胞成像的自动显微镜上的附加组件。图4（a）所示的荧光滤色片光谱显示了激发、吸收（发射）和二向色镜组件的透射光谱之间的关系。这些滤光片通常可以很方便地安装在一个光学模块中，这个模块可以与其他附加的荧光滤光片组一起装入荧光激发块转盘中（图4（b））。双通道成像系统（图4（c））和10位滤色镜转轮（图4（d））设计用于快速交换激励或发射滤波器（滤波器轮）或同时从两个滤色镜通道收集图像。电动光闸系统（图4（e））和电动载物台（图4（f））使显微镜能够限制样品的照明，并从一个位置快速转换到另一个位置。具有自动轴向控制的电动载物台在反卷积研究中是十分有用的，对于许多商用自动对焦机构来说是必要的。
上面提到的这些只是在传统的活细胞工作站照明系统中常见的设备，在我们的Etaluma活细胞工作站LS720中已经无法看到了，取而代之的是LED照明和独特的固态照明系统。
LED具有弧光灯所有理想的特性，由低压可切换电源供电，其切换速度可以大大超过机械设备，如滤色片转轮。LED提供的不同光谱输出使选择单个波长作为光源成为可能，为跨越紫外、可见光到近红外区域的荧光提供最佳激发波长带。我们的LS720选择了常用的405,488,590三个独立LED作为荧光光源，配合Semrock公司一组多波段Pinkel系列滤色镜组，满足实验中常见的红绿蓝三色荧光成像需求。由于没有了需要切换的机械部件，所以不会产生一般显微镜中像素偏移的问题。这套特有的固态光学系统给活细胞实验提供了一个全新的方案。
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