近年来，基因疗法产品的潜能正在被迅速挖掘，引起科研工作者的强烈关注。如何确保基因疗法产品的质量？以最常用于体内注射的载体腺病毒或腺相关病毒（AAV）为例，其本身结构复杂、样品量有限以及低浓度等因素给产品重要属性的表征带来极大挑战。行业迫切需要一种分析技术，帮助建立结构-功能关系、指导制造工艺的开发，评估临床材料的质量。
今天小编带您了解沃特世公司与合作伙伴共同开发的精简、耐用的LC和LC-MS工作流程，帮助解决病毒载体工艺开发和制造稳定性、规模化生产等相关问题，加速实现临床转化。
图1：腺相关病毒 (Adeno-associated Virus, AAV)结构示意图
Molecular Therapy 2016, vol. 24(3) P。
LC-MS分析增强对产品质量与过程的理解
FDA已经发布了基因治疗产品进入临床所需的CMC信息的指南，它包括确认衣壳的鉴别、衣壳结构和纯度的详细表征，还特别强调使用不同测试方法评估相同质量属性，并提到了以往常被忽略的翻译后修饰（PTM）。传统凝胶电泳（SDS-PAGE）不能识别过程开发批次中的一种新的蛋白杂质，而LC-MS方法却能识别出传统SDS-PAGE法检测不到的产品杂质，增强了对产品质量与过程参数的理解。
图2：LC-MS方法可识别出SDS-PAGE检测不到的产品杂质。
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用于完整VP蛋白分析的LC-MS法
高分辨率的色谱分离使得质谱能够测定和监测衣壳蛋白的剪切体/截断体、异构体。如下(a)是C4色谱柱上分离的AAV8衣壳蛋白的代表性数据， 色谱图提供了有关衣壳蛋白的比例和纯度的信息，可以观察到在主峰之后的剪切形式VP3。准确的质量数可以通过去卷积质谱图(b)获得，以确认衣壳蛋白的身份鉴别。质谱检测能获得每个峰的质量数信息，并将观察到的质量与预期的氨基酸序列质量进行比较，可以提供同一性保证。另外，在完整的蛋白水平上，还观察到主要的PTM， 例如磷酸化（由于转导效率降低，AAV2的磷酸化变体的效能较低，这一发现非常重要，可能是结构与功能关系的重要方面）。
图3: 六种AAV 血清型荧光检测结果及AAV8中VP1, VP2, VP3和VP3 片段的去卷积图谱。
由于可用于分析的样品量往往受到限制，所以单个分析中可衡量的属性越多越好。使用这种完整蛋白方法， 可对衣壳蛋白的纯度、比率、同一性和PTM进行评估， 且所有操作均使用约1 µg蛋白质即可一次完成。值得注意的是，其他血清型衣壳蛋白的色谱法有所不同，需要进行一些方法优化，色谱柱筛选始终是方法开发的重要组成部分。Regeneron最近发表论文，使用HILIC替代反相方法实现了衣壳蛋白及其各种修饰形式的良好分离。这种方法的困难在于流动相中使用到TFA，会显著影响MS灵敏度。作者通过向去溶剂化气体中引入修饰剂克服这一问题，以提高质谱数据的质量。
用于VP蛋白的LC-MS肽图分析
的确，人们可以通过对整个基因组测序，如使用下一代测序或通过ELISA 检测存在的病毒颗粒来确认载体身份。但ELISA的血清型是特定的，如果要处理不同的血清型，则需要为每种血清型建立新的检测方法。Merck KGaA与沃特世公司合作开发的基于LC-MS的血清型鉴别提供了正交的方法。尽管不同形式的AAV之间存在高度的序列同源性，但可以寻找出独特的肽段以鉴定特定的血清型。
图4: LC–MS 方法分析 AAV （使用1.25 μg蛋白制备的酶解溶液）。
深度表征衣壳蛋白PTM鉴定和丰度
通过肽图分析，可以鉴别衣壳、鉴定蛋白的PTM，还可以通过二硫键分析确定半胱氨酸氧化状态、表征未知峰/杂质 (如HCP)等。针对开发肽图分析的挑战如样品量有限(µg/mL级别)、制剂中含有表面活性剂、置换缓冲液时回收率降低等问题。沃特世科学家们使用1.25 µg蛋白作为起始原料，开发出酶解肽图分析方法。经UNIFI处理，获得>95% 的序列覆盖度，鉴定到包括N-端乙酰化、磷酸化、脱酰胺、氧化等修饰。
图5：通过碎片图谱实现衣壳蛋白PTM鉴定。
有两种类型的杂质对衣壳纯度测量特别重要，即空衣壳和聚集体。目前人们还不完全了解空衣壳的临床意义， 空衣壳是不包含基因组的病毒颗粒，但却被认为对安全性和功效具有潜在影响，需要对其进行监视和控制。
用于完整衣壳分析的阴离子交换色谱（AEC）
有多种分析方法可以测量空壳与满壳的比率，但各有局限性，所以常结合多种方法对该属性进行评估。对于空的完整衣壳分析，与分析型超速离心（AUC）相比，AEC简单、通量高、精度高且消耗样品少，可以有效应对基因治疗产品分析中材料供应有限这一挑战。因此，AEC 可能提供一种有用的补充技术，来指导流程和产品开发，并监控产品质量。空壳和满壳的分离基于其在表面电荷上的明显差异， 由于基因组填充、键合更强，满壳在离子交换柱上的保留时间更长。不过，由于色谱法取决于血清型，因此每种新产品都需要开发方法。如图，沃特世科学家团队从从一系列稀释中制备出来样品（2.4 X 1012 和1.67 X 1012 衣壳/mL，由CDMS测定空壳率为2.1%和98.5%，CDMS 确定AEC模式的空壳蛋白异质性来自于电荷差异），就此开发了AEC用于rAAV8空衣壳蛋白定量的方法，数据显示测定值与预测值显示良好的相关性，结果作为封面文章发表在LCGC上。
图 6: 使用优化的离子交换方法分析rAAV8 样品的图谱。
用于聚集体、碎片、浓度分析的体积排阻色谱（SEC）
聚集体由于其安全性以及它们是常见的降解产物而成为AAV的关注点。对于AAV，人们经常使用动态光散射作为对单分散性的简单、定性评估。这种情况同样需要正交方法以及改进的定量方法。尺寸排阻色谱法（SEC）传统上是测量治疗性蛋白质聚集体的一种成熟技术。虽然AAV比单克隆抗体分子量大得多，但两者有相似的水动力学半径，可以利用SEC色谱填料上孔径大小的异质性，使用孔径较大的SEC色谱柱（如450Å BEH SEC）分离出高分子量的 AAV。
图7：SEC 技术可以很好地分离衣壳单体与聚集体。
图8：优化的非变性SEC方法用于几种rAAV-CMV-GFP血清型的分离。
比对性研究支持AAV载体生产的过程开发
在AAV样品中观察到不同的效力，应综合采取如RP-LC-FLR 谱型、蛋白比率、病毒蛋白的磷酸化水平等分析技术去理解和比对样品差异所在。沃特世公司与Sanofi Framingham合作开发了基于LC-MS方法用于比对性研究以支持AAV载体生产的过程开发。如下图，发现不同样品间准确分子量是一致的，而在样品2A中观察到其VP2的丰度（结果与CE-SDS分析吻合）和磷酸化水平与其它批次（1A，1B）是不同的。该方法可以作为产品的测量、拓展CQA范围，然后使用CQA去开发过程参数与临床产出的关联，以指导过程开发。
图9：样品2A中观察到VP2丰度和磷酸化水平与其它批次不同。
综上，对于基因治疗产品不同属性的测量，需要结合几种不同的方法来表征结构和纯度的每个方面。随着临床对 rAAV 基因的兴趣增加，优化 rAAV 制造过程的产品功效和效率至关重要。LC 和 LC–MS 技术在重组蛋白疗法的开发、鉴定和质量测试中已有悠久的应用历史，很可能成为 rAAV 基因疗法以及其他病毒和非病毒基因治疗开发的有力工具。
参考文献
1. Stephan M. Koza, Ximo Zhang, Hua Yang, Weibin Chen, Applying Liquid Chromatography (LC) and Liquid Chromatography–Mass Spectrometry (LC–MS) Methods to the Characterization and Analysis of rAAV，LCGC NORTH AMERICA VOL 38(12), 654-661.
2. H. Yang, S. Koza, and W. Chen, Anion-exchange chromatography for determining empty and full capsid contents in adeno-associated virus 2020. Waters Application Note (2020).
3. S. Koza and W. Chen, Size-Exclusion Chromatography Analysis of Adeno- Associated Virus (AAV) Preparations Using a 450 Å Diol-Bonded BEH Column and Fluorescence Detection 2020. Waters Application Note (2020).
4. S. Koza and W. Chen, Rapid AAV Concentration Determination Using Size-Exclusion Chromatography with Fluorescence and UV Dual Detection 2020. Waters Application Note (2020).
5. H. Runnels, ed. Gene Therapy and AAV: Advancing Analytical Characterization and Product Understanding for Late-Stage Success (WCBP, Washington DC, 2019).
6. X. Zhang, S.M. Koza, Y.Q. Yu, and W. Chen, Optimizing Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Protein Analysis Using UPLC and UPLC-MS. Waters Application Note. 2020, EN72000686.
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