在反相液相色谱分析方法开发前，我们需要了解化合物的结构及性质。施耐德疏水减法方程明确了在反相液相色谱分离过程中的几种作用力，具体见下图。
LogD能表征各种化合物在不同pH条件下的疏水性。反相液相色谱方法开发过程中，化合物的疏水性（方程式中的η）影响色谱条件的筛选策略制定，包括色谱柱种类、缓冲液pH值、有机相种类与比例等参数。
接下来我们通过几组化合物的pH-logD曲线，简单介绍不同情况下的液相分析方法开发策略。
上述四种化合物均为中性样品，有疏水性（logD数值）差异，且logD数值均大于0，因此在反相色谱体系下有很好的保留。在反相体系中，logD数值越小，保留越弱，logD数值越大，保留越强。此时流动相无需使用缓冲液，亦无须调节pH。色谱柱也可简单选取普通C18色谱柱即可，结构中无可电离基团也无氢键作用基团，因此预测峰形较好。
上述化合物分别为中性、碱性，酸性、两性化合物。其中含有可电离基团的三种化合物的疏水性（logD数值）随流动相pH值会发生显著变化。ID2的logD在pH＜7时低于-0.5，ID3在pH＞7时低于-0.5，根据经验，当logD＜-0.5时，仅靠化合物与色谱柱的疏水作用无法使化合物在普通C18色谱柱上获得保留，因此在必要时需要依靠色谱体系中的其他作用力增强化合物保留。基于前述情况，可以选择包括但不限于以下几种策略进行液相分析方法开发：
A：当选用pH＜5的流动相时，可以使用阳离子交换试剂（烷基磺酸钠等），增强碱性化合物（ID2、ID4）在酸性条件下的保留。
B：当选用pH＜5的流动相时，也可以使用离液剂溶液（高氯酸钠等），增加碱性化合物（ID2、ID4）在酸性条件下的保留。
C：当选用pH＞9的流动相时，可以采用阴离子交换试剂（四丁基铵等），确保碱性基团呈分子态；酸性基团全部电离，且与四丁基铵结合，增强含羧酸化合物（ID3、ID4）的保留。
D：采用带离子交换的混合模式C18柱，以离子交换作用增加离子化合物的保留，应注意选择离子交换色谱柱的填料类型。
从上图可知信息如下：
A：上述化合物的疏水性均较小（logD绝大多数为负值），仅靠C18柱提供的疏水作用无法使其获得保留。
B：上述化合物的疏水性受pH影响较大，因此流动相pH值很可能是影响上述化合物保留行为的关键因素。
C：ID2、ID5、ID6疏水性接近，从结构分析，ID5与ID6仅在红色线框内的磷酸基取代位置不同；ID2与ID5、ID6的红色线框内的碳原子数量不同，同时蓝色线框内，ID2无环状结构，因此可能存在氢键及离子作用差异。
基于上述信息，在液相分析方法开发过程中，需要有针对性地选择多种作用力存在的色谱体系，建议使用具有离子交换和氢键作用的色谱柱。
预测化合物logD值，会提醒分析工作者关注化合物之间的结构差异，进而关注化合物之间的疏水作用强弱差异、色谱柱填料带来的其他作用力的差异，从而有针对性地开展色谱条件筛选工作。上述三种情况仅仅是有代表性的几种pH-logD的应用场景，实际的液相分析方法开发过程中，情况会复杂很多。往期的文章中，也有根据pH-logD曲线差异制定液相分析方法开发策略的案例。
以下案例请分别点击查看
根据以下化合物结构以及pH-logD曲线，如何制定反相液相色谱分析方法开发策略？
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