病毒样颗粒 (VLPs) 是一种多聚蛋白质结构，与天然病毒相似，但不具有传染性。VLPs在研制新型疫苗和基因治疗产品方面的潜力越来越大。目前，已经有商用VLP疫苗用于防治乙型肝炎和人乳头瘤病毒。为了确保最终产品的质量，以及向开发过程中的知情决策提供数据支持，我们需要切实可靠的分析技术。
尺寸排阻色谱 (SEC) 技术能够分析出大分子的尺寸和纯度，在与多角度光散射 (MALS) 检测器结合使用时，不仅可以测定分子量 (MW)，还能够计算出回转半径 (Rg)。不同于AU280浓度型检测器，MALS对样品浓度和分子量均有响应。由于VLPs的分子量较大，MALS检测器散射光响应信号强，所以即使在远低于AU280检测限的稀溶液中仍然可实现VLP检测。
本应用中介绍了利用SEC-MALS分析技术，采用TSKgel PWXL系列SEC色谱柱配合东曹的超高灵敏度LenS3 MALS检测器，可快速、简便地测定细小病毒VLP的分子量和回转半径。
VLPs分析用色谱柱的选择
TSKgel PWXL系列色谱柱的固定相基质为不同孔径的聚甲基丙烯酸酯。图1的蛋白质校准曲线显示了该系列色谱柱的分离范围。大多数VLPs的分子量在1×106 Da以上，因此，G5000PWXL (孔径100 nm)、G6000PWXL (孔径＞100 nm) 和GMPWXL (混合床) 这三款色谱柱都是分析VLPs的理想选择。
图1 PWXL色谱柱的蛋白质校准曲线
细小病毒VLP的SEC-MALS分析
本应用中采用了GMPWXL和G5000PWXL色谱柱，分别与LenS3 MALS检测器联用分析细小病毒VLP。RI或UV都可用作浓度检测器。RI配合直角光散射信号 (RALS) 用来测量MW。极小角度(LALS)、直角和极大角度 (HALS) 信号用于角不对称性图的绘制以及测定Rg。分析样品之前，先用BSA校准MALS检测器，然后使用SECview软件处理和分析数据。
GMPWXL色谱柱对细小病毒VLP的SEC-MALS分析结果，揭示其MW约为4×106Da，Rg为12.8 nm。这些结果与该VLP的报告值非常吻合 (Biotech. Prog.34, 1213-1220, 2018)。
图2 GMPWXL混合床色谱柱分析细小病毒VLP和BSA
随后，将细小病毒VLP稀释至64倍，进样10 μL到G5000PWXL色谱柱中。通过MALS检测器的RALS信号，仍可以检测到每毫升约3×1010个颗粒，由此可见该方法可用于分析低浓度样品或微量样品的检测。
图3 G5000PWXL在0.5 mL/min下通过RALS的检测限
结果与讨论
以前，质谱是测定VLP尺寸最常用的方法，但该技术成本高昂且不适合进行频繁的分析。更好的替代方法是使用SEC-MALS来测定MW和Rg，该技术不仅能够进行常规分析，还可以执行过程监控。
TSKgel PWXL系列SEC色谱柱的孔径和分离范围均比较宽，可以有效应对超大分子分析中面临的挑战。而且，此类色谱柱配合超高灵敏度的LenS3 MALS检测器，可以快速、简便地进行MW和Rg的高水平分析。
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