关于液相色谱仪的检定都在这了！

液相色谱仪由输液系统 (包括输液泵、流动相储器和梯度仪) 、进样系统、分离系统 (包括色谱柱和柱恒温器等) 、检测系统和数据处理系统等组成。流动相被高压泵打入系统中, 混合样品溶液由进样系统注入, 跟随流动相流入色谱柱。由于混合样品中不同组分在固定相和流动相间的吸附与分配系数不同而产生不同的运动速度, 经多次吸附-解析过程逐步分离, 由流动相带入检测器中, 并转换成电信号输送至记录仪, 以色谱图形式输出, 进行定性或定量分析。

新规程在后续检定中主要考察仪器以下几项技术指标。

将仪器各部分连接好, 流动相用100%甲醇, 通过工作站或仪器操作面板设置检定流量 (如表1所示, 选择高、中、低三档流量逐一测定) , 启动仪器, 待压力稳定后, 在流动相出口处用容量瓶 (空瓶质量为W1) 收集流出液, 并同时用秒表计时t。在经检定合格的分析天平上称重, 质量为W2, 按式 (2) 、 (3) 计算实际所测流量值Fm, 重复三次, 得三次实测流量平均值, 按式 (1) 计算SR。SR为三档流量中最大值。

其中ρt为经温度校正后的甲醇密度, T为测定流速时温度。

表1 泵流量设定值和收集时间

选用100%甲醇为流动相, 流速定为1.0 m L/min, C18色谱柱, 开启仪器, 基线稳定后记录30 min, 读取瞬时最大基线峰-峰高值, 再乘以检测器衰减倍数得到基线噪声 (Nd) , 30 min内基线偏离起始点的最大值为基线漂移, 均用仪器自身物理量表示。不同检测器自身物理量和检定条件如表2所示。

表2 检测器自身物理量和检定条件

检定条件同2.2, 记录进样量V为10~20μL标准物质 (表3) 所得色谱图, 积分得色谱峰高H, 根据式 (4) 计算最小检测浓度CL。

表3 最小检测浓度检定标准物质选用

检定条件同2.2, 注入一定体积标准物质 (表4) 得色谱图, 积分得色谱峰保留时间 (用于定性) 和峰面积 (用于定量) , 重复6次, 根据式 (5) 分别计算定性、定量重复性。

表4 整机性能检定标准物质选用

1) 泵流量误差检定中, 新规程增加了不同温度下流动相密度的折算公式, 引入了温度校正系数 (0.000 93 g/cm3·℃-1) , 减小了由温度变化引起的误差。但甲醇具有一定挥发性, 所以每次收集完流动相, 应迅速盖上瓶塞及时称重, 且三次计时和收集流出液应配合熟练, 尽量降低人为误差对泵流量稳定性的影响。

2) 基线稳定性是仪器性能好坏的一项重要指标, 液相色谱仪系统中若有未被排出的气泡则会引起谱带展宽, 干扰检测器正常工作, 影响基线稳定, 使噪声偏大, 因此在运行检定之前应先充分脱气, 并用流动相冲洗泵和检测器。

3) 新规程中所有检测器的性能检定均使用100%甲醇作为流动相。色谱级甲醇是实验室中易得的常用试剂, 针对多个检测器串联的仪器使用相同的流动相可避免在切换检测器进行检定时重新脱气、冲洗系统, 大大缩短了检定时间。

4) 原JJG 705-2002中荧光检测器和示差折光率检测器在检定时分别选用的标准物质为硫酸奎宁/高氯酸水溶液和丙三醇/水溶液, 但在检定过程中发现这两种标准物质的峰型较差, 不可避免存在裂峰, 且经常伴有一些杂峰难以区分, 重现性较差, 给检定带来一定困难。荧光检测器是利用化合物具有光致发光性质, 受紫外光激发, 能发射比激发波长较长的荧光对组分进行检测, 因此需要化合物中具有能够产生荧光的不饱和共轭键, 新规程采用萘-甲醇溶液标准物质出峰利落, 且对称性较好, 可达到良好的分析效果。

5) 蒸发光散射检测器是新规程中新增的检测器。在以往的校准工作中笔者一般采用85%甲醇/水作流动相, 糖柱, 葡萄糖为标准物质进行校验, 峰型清楚, 且重现性较好。新规程中采用胆固醇-甲醇溶液作为检定用标准物质, 可直接使用C18柱, 且流动相中没有水的存在, 大大减小了对仪器本底造成的影响。

6) 选用胆固醇-甲醇溶液作为示差折光率检测器和蒸发光散射检测器检定用标准物质时, 会在进样初期出现倒峰, 特别是对示差折光率检测器来说, 胆固醇的响应值较低, 影响到整机性能的检定。由于定性重复性和定量重复性是根据6次进样的相对标准偏差得到的, 是一个统计的概念, 与进样量无关, 因此可以适当增加进样量以利于积分。

主要修订内容:增加了蒸发光散射检测器的检定内容, 同时将旧规程中荧光检测器检定用标准物质由硫酸奎宁-高氯酸水溶液改为萘-甲醇溶液, 将示差折光率检测器检定用标准物质由原来的丙三醇-水溶液改为甲醇中胆固醇溶液标准物质等。下面对修订的相应内容进行具体介绍及解释:

根据JJF1002-2010《国家计量检定规程编写规范》的规定, 引言内容为必备章节, 主要列出了与旧规程相比较的主要技术变化, 所替代规程的历次版本发布情况等。

本次修订增加了蒸发光散射检测器的检定内容, 并且根据对不同厂家生产的不同型号的新、老仪器进行实验, 同时与生产厂家的技术人员和用户单位实验人员进行多次沟通、讨论, 反复征求各方面专家意见后制定蒸发光散射检测器的各项检定技术指标 (见表1) , 并通过实验数据证明了其合理性和可行性。

用标准物质由硫酸奎宁/高氯酸水溶液修改为萘-甲醇溶液标准物质。旧规程中荧光检测器检定用标准物质为硫酸奎宁-高氯酸水溶液, 由于硫酸奎宁为水溶性, 因此在检定过程中为了增加洗脱能力需要在流动相中加一定量的水。即便如此, 由于仪器的各种原因, 经常出现信号不理想等情况, 导致检定不能顺利进行。根据实验和以往经验, 本次修订中将其改为萘-甲醇溶液标准物质, 并通过实验验证, 避免了上述问题的出现。若检定中同时有紫外或二极管阵列检测器, 可以不改变流动相的组成, 甚至可以同荧光检测器串联在一起进行检定, 提高了检定效率。

用标准物质由原来的丙三醇-水溶液修改为甲醇中胆固醇溶液标准物质。旧规程中示差折光率检测器检定用标准物质为丙三醇-水溶液, 但由于其稳定性的原因至今未申报国家有证标准物质, 不符合量值溯源要求。经过实验证明, 胆固醇-甲醇溶液完全可以替代之, 并且使得两种通用型检测器 (示差折光率检测器和蒸发光散射检测器) 使用同一种标准物质, 既方便使用又减少检定成本。

旧规程中对检测器换挡误差的检定是为了满足以记录仪为数据处理器的液相色谱仪的需求, 而随着近年来仪器突飞猛进的发展, 以记录仪为数据处理器的液相色谱仪已经逐渐被淘汰, 因此, 本次修订不再保留该项检定内容。

表5 蒸发光散射检测器的主要技术指标

表6 检测器最小检测浓度指标变化

表7 修订的检定项目

(1) 整机定性重复性由原来的1.5%修改为1.0%。

(2) 检测器基线噪声和漂移采集时间由原来的1h改为30min。

(3) 检测器最小检测浓度的指标变化如表2所示。

为了方便对泵梯度误差的检定, 增加了梯度参考程序供参考使用。