新版《中国药典》中各种生物检定统计法的计算

目前世界上主要的、影响最大的三部药典，即《美国药典》、《欧洲药典》及《中国药典》分别都对生物检定统计法进行了相应描述和说明。但是过去因为各国和组织针对生物检定统计法采用了不同规范要求（即算法差异），虽然各自都有其自身优缺点，但是致使具有分析方法多样、可比性差，应用范围受限等不足之处。

《中国药典》一般每 5 年修改一次，继上一次 2015 版《中国药典》之后，2020 版的《中国药典》的编写现在已经进入比较后期的阶段。根据第二次征求意见稿中的描述，本次药典修改中生物检定法的相关内容发生了比较大的变化，相关实验的数据分析和统计方式将相应发生改变。

目前生物检定法用于定性测试潜在药物（化合物）的活性，或者定量的测定其有效剂量，反映出某生物或生物性材料对外来化合物的刺激反应情况。而生物检定统计法是将生物检定及统计学方法相结合，其成为生物学、医学、毒理学的重要内容和基础，在研究新药（化合物）的过程中，生物检定统计法发挥着关键性的作用。

因为生物检定统计分析方法主要是结合了统计分析的原理，从定量或定性数据出发，进行实验的设计，结果的分析，严谨和科学的来探索药物量效关系，通常情况下生物检定统计的方法常用于特殊物质和不能通过实验直接确定性质的药物制剂的检测，为统计学的结构，需要验证性分析。

我国在 2015 版及较早 2010 版的《中国药典》中第三部及第四部通则中均对生物检定统计法做出了详细解释，即利用生物体包括整体动物、离体组织、器官、细胞和微生物等评估药物生物活性的一种方法。以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计在一定条件下比较供试品和与其相当的标准品或对照品所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性。

目前我们使用的 2015 版本的《中国药典》中仅有量反应的分析方法，且对异常值的检验仅给出 Dixon 法，我们首次提出了可信限率概念和计算公式，相对于简便些，这对于生物检定方法是非常重要的指标，并得到国际其他相关组织认可。但是内容相比《美国药典》和《欧洲药典》来说，我们采用的方案和算法不够丰富，制约了研究人员灵活应用各种模型方法和算法，适用范围受到限制。如《美国药典》在异常值判断给出了较为全面分析方式，《欧洲药典》内容相较于其他两家来说较为全面，包括量反应、质反应的常规统计方法外，还加入四参数方法。

我们知道 2015 及以前版本的《中国药典》中针对生物检定统计法的应用是从生物检定标准品（S）、供试品（T 或 U）、等反应剂量对比（T 和其 S 相同实验条件下同时对生物体等作用进行比较，计算它们的等反应剂量比值 R，测定 PT 效价）、生物变异的控制、误差项、可靠性检验、可信限和可信限率等方面都给出了相应的规定。

随着学科水平不断提高，生物科学不断创新，带动了生物检定统计技术的逐步发展，以往版本的《中国药典》中针对生物检定统计方法，如直接测定法、量反应平行性法如今已不能有效满足检定统计更高的需求。那么就需要新版本的药典在其相关原则的规定必须进行相应的改善，同时我们国家为了适应未来药品生产、供应、使用和管理变化，保证药品质量和保障用药安全。

在 2020 版本的《中国药典》中将会引入新的检定统计的评价方式，即四参数回归计算方法，在此基础之上将对可靠性检验、可信限和可信限率进行相应内容上的增加和修改。例如可靠性检验中要求剂量或对数剂量反应符合特定模型要求，且供试品与标准品的线性满足计算原理的要求，新加入的四参数模型中要求所用剂量范围内，对数剂量与反应（或反应函数）呈现 S 曲线关系，供试品和标准品的 S 曲线为平行关系。此外在新版药典中将采用概率推断法 那么准确的表述方式将可信限称之位置信限，通常也会描述其置信区间的大小。

那么以下内容将会对 2020 新版《中国药典》出现的测定方法、手段等，并且如何使用 SoftMax Pro 软件进行相应设置、计算及应用方式做一个简单、易懂介绍。针对新的评价手段 Molecular Devices 公司借助于酶标仪 SoftMax Pro 软件强大运算、曲线拟合、函数编辑功能，当然，您也可以借助于目前有针对各种分析检测方法成熟模板，进行直接套用，这样省去了很多的时间。

直接测得药物对各个动物最小效量或最小致死量的检定方法。如药物或潜在化合物的效价测定，针对效价测定使用软件标准模板设置即可实现，较为简便，这里就不在详细描述。

目前大家较常见的是采用量反应平行线测定法（PLA），当大家无法直接检测一个生物制品的活性而只能通过检测其产生的效果时，PLA 方法通常会被用来进行效应曲线的比较来获得此制品的效果。原理是药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者称量反应。

量反应检定用平行线测定法，要求在一定剂量范围内，S 和 T 的对数剂量x和反应或反应的特定函数y呈直线关系，当 S 和 T 的活性组分基本相同时，两直线平行。

当两条曲线被判定为平行时，其中一条曲线的函数可以通过通过另一条曲线的函数乘上一个比例系数向X轴的左边或右边变换获得：ƒ(x) = ƒ(rx), 其中x是剂量，r是比例系数或相对活性（图1）。

图1：线性回归平行线模型。

参考曲线的相对活性(红色圈)设为1，用来变换参考曲线为测试曲线(蓝色圈)使用的校正因子即是未知品的相对活性。

对于相对活性，一般将参考品（已知品）的活性设为 1，可以使用一个比例系数可以将参考品的曲线变换为测试品（未知品）曲线，那么这比例系数则被称之为测试品的相对活性。目前药典要求相邻高低剂量组的比值r要相等，用（1:0.8）~（1:0.5），这些运算是比较简单，可以通过 SoftMax Pro 软件直接计算线性拟合的相对活性，获得位移的相对 r 值。

这个方法应用于线性拟合的曲线非常合适，因为线性拟合的曲线在整个浓度范围内的曲线斜率是保持一致的。但是由于根据实际实验中的数据，很难获得完全平行的拟合曲线，尤其对于非线性拟合回归，而计算非平行曲线获得相对活性是很困难的。

众所周知，四参数回归计算法系采用非线性模型进行量反应检定的一种统计分析方法。该法要求在一定剂量范围内，标准品（S）和供试品（T） 的对数剂量 x 与反应值或反应值的特定函数y呈“S”或反“S”形关系，拟合成四参数逻辑（logistic）回归方程，拟合曲线对称于拐点，上下各有一渐进线，SoftMax Pro 软件可以选择非约束模型（自由模型）和约束模型，其按照非线性最小二乘法原则，可以分别获得 S 和 T 非约束拟合以及约束拟合曲线。

当 S 和 T 的活性组分基本相同时，两拟合曲线平行。我们可以利用标准品和供试品的曲线使用约束模型进行拟合，这时曲线强制平行，SoftMax Pro软件同时可使用约束性模型（全局拟合模型）和非约束模型对非线性拟合曲线进行评价和计算相对活性（图 2，图 3）。

图 2：四参数拟合曲线-约束型模型

图 3：四参数拟合曲线-非约束型模型

已知 SoftMax Pro 软件内置 4 参数或 5 参数曲线拟合模板，可以直接给出约束型或非约束型两组曲线，并根据约束型模型计算出卡方检验值、卡方检验概率分布值、F 检验值、F 检验概率分布值，同时也会给出约束型曲线拟合A 值、B 值、C 值、D 值、G 值（注：5 参数曲线拟合独有）的置信区间范围，即其上限和下限值等。

如果大家对此部分内容感兴趣，可以参考我们《使用 Molecular Devices 最新发布的SoftMax Pro 7 软件进行平行线分析和相对活性评价》这篇应用文章（可在微信公众号下方菜单资源库中查找到），以及可以直接下载此应用文章相关的软件分析模板。

针对 2020 版本《中国药典》第二次征求意见稿-1431 生物检定统计方法中，正式的将四参数回归计算法列入其中后，相较于《欧洲药典》和《美国药典》来说，补充了新的评价手段方法，完善了这方面不足，SoftMax Pro 软件针对这一次变化，利用其软件函数编辑功能、21 种曲线拟合及 PLA分 析功能等。

结合征求意见稿将新的方法及要求编辑成函数语句，制作成软件模板，可将生成数据直接进行判断，给出意见稿需要检测结果，我们将针对这次征求意见稿这部分要求内容以及如何在相应模板中找到所需或所对应要求的检测结果进行说明：

效价及置信区间的计算，采用约束模型中 S 和 T 拟合曲线 EC50 的比值，计算供试品的相对效价 R，即 R=(标准品 EC50/供试品 EC50)*100%, 其次要经过软件直接获得供试品的置信区间上限和下限，即 R 置信区间的值。

可靠性测验结果的判断，如果实验结果需要成立：

（1）新的要求是根据历史数据设定 S 和 T 拟合曲线 R2 应 ≥0.98 ，符合规定。

（2）S 和 T 每一剂量组内反应值的 RSD 均 ＜10%，这里的 RSD 值为标准品和样品复孔之间的所有 Cv 值的最大值均小于 10% 为符合规定。

（3）回归项非常显著。

（4）偏离平行和失拟检验项均不显著。

采用 SoftMax Pro 软件设置的模板，结果判断标准通过 If 函数的逻辑判断语句，通过对详细条件 1、2、3、4，其中回归非常显著性判断和偏离平行和失拟检验项不显著条件判断，需要来源于其他函数计算结果进行判断获得

然而这些判断函数来源于底层判断方式建立，如下所示，方差分析要求

我们国家目前对量反应平行线法的各种情况讨论的较为详细。在进行量反应平行线选择正确的曲线拟合方式和权重因子，来消除这些噪声和波动是进行平行性评价前的首要一步。权重因子帮助您尽可能逼近真实值。何时需要加权以及如何进行加权，如果对这部分感兴趣可参考《如何在 SoftMax Pro 7 软件中选择最佳权重因子》这篇应用文章（可在微信公众号下方菜单资源库中查找到）。里面详细解释权重因子概念以及如何选择合适加权方式。

生物制药及相关企业面对 SoftMax Pro 软件作为一款功能强大的数据获取和分析软件，同时，针对企业版用户对数据审计和追踪功能要求， SoftMax Pro GxP 7.1 版本软件符合 2016 版的  FDA 21 CFR Part 11 的工作流程，以确保您获得数据的完整性。每个步骤都经过优化，其目的是简化分析流程和报告生成时间，以便于支持我们的微孔板读板机更快获得完整、可靠的数据。

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