肿瘤早筛系列 | 液体活检技术及应用

海狸生物医学

2021.8.24

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根据CA期刊近期发布的全球最新癌症统计数据，2020年中国癌症新发病例457万例，死亡病例300万例，发病人数和死亡人数均位居全球第一。癌症严重危害居民健康，传统筛查方法效率过低。癌症早诊早治可提早发现肿瘤病变，提高患者生存率，节省治疗费用。

肿瘤早筛提供新思路——液体活检技术

传统癌症筛查的手段主要集中在影像学筛查（彩超、CT、核磁等）、内镜筛查（胃镜、肠镜等）、肿瘤标志物筛查（PSA、AFP 等），存在侵入性强、灵敏度差、依从性低等缺陷。液体活检技术，也被称为肿瘤无创诊断技术，是指通过血液、唾液、尿液等体液对癌症进行诊断的技术，具有无创、高效、准确等优点。液体活检能够早于影像学检测发现肿瘤，研究表明肿瘤患者的早期血液中就已经出现ctDNA，这无疑对癌症的早期诊断有很大的临床意义。

1997 年，卢煜明等在国际著名医学期刊《柳叶刀》上发布的文章中表明孕妇的血浆内存有较高浓度的胎儿 DNA，可用于唐氏综合征的无创产前诊断（NIPT）。2015年，液体活检被《麻省理工大学科技评论》评选为“十大突破技术”。近些年来，液体活检技术被再次延伸至肿瘤学相关研究，能够早于影像学检测发现肿瘤，研究表明肿瘤患者的早期血液中就已经出现ctDNA，这无疑对癌症的早期诊断有很大的临床意义。

液体活检原理及肿瘤学应用方向

图片来源：《Clinical Cancer Research》（2017）

海狸液体活检131解决方案

BEAVER

1 cfDNA Tubes 游离核酸保存

3 BeaverBeads

1 Rosetta 24/96 自动化核酸提取仪

液体活检三大标志物

目前可用于肿瘤液体活检技术的检测物主要包括 CTC、ctDNA、外泌体，不同靶标类型具有不同的检测特点。

液体活检靶标类型

图片来源：《Journal of Clinical Medicine》

CTC

CTC是实体瘤释放到外周血中的循环肿瘤细胞，CTC在肿瘤发生早期由原发肿瘤进入血液，可以通过其物理化学特性的差异从正常血细胞中分离出来，主要用于癌症的实时监测，判断预后等。在结直肠癌领域，CTC不论是在预后评估、疗效和复发监测、动态监测以及辅助诊断和早筛方面都意义重大。

外泌体

一种细胞原性的囊泡，其内含有蛋白质和 miRNA 等遗传物质，通过对肿瘤性外泌体的检测分析可以得到肿瘤细胞的相关信息。ExoDx Prostate IntelliScore（EPI）在2016年被批准用于诊断前列腺癌，外泌体能通过表面标志物进行富集，并且可以通过肿瘤特异性和肿瘤富集的表面蛋白标志物进行外泌体亚类的区分，将外泌体与ctDNA联合，可提高液体活检突变检测敏感性。

ctDNA

ctDNA是指坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤DNA片段，其带有肿瘤特异性突变或表观遗传学改变，是目前最受关注的液体活检技术。主要用于癌症早期筛查，个性化用药指导和耐药性分析。2015年FDA批准凯杰的therascreen EGFR试剂盒作为伴随诊断试剂指导阿斯利康公司的易瑞沙治疗晚期或转移性非小细胞肺癌，实现指导用药。2016 年ctDNA检测指导非小细胞肺癌 EGFR靶向治疗被美国国家综合癌症网络写入《非小细胞临床实践指南》；与 CTC 检测相比，ctDNA检测可以提供个性化的疾病检测方案，在癌症早期检测的敏感性相对更高，成为目前市场上应用最为广泛的靶标类型。

液体活检——检测难度

CTC＞外分泌体＞cTDNA

三种检测技术发展现状也大不相同，CTC捕获率较低，灵敏度差；外分泌体具备稳定性强，可长期储存优势，但目前刚起步阶段，技术非常不成熟；ctDNA是较为成熟的技术手段，其严重受限于肿瘤基因组认知水平。

ctDNA技术路线各有不同

突变检测

肿瘤患者的肿瘤细胞在破裂时，会释放DNA到血液中，即为循环肿瘤DNA（ctDNA）。检测血液中的ctDNA对肿瘤早筛、用药和预后具有重要临床指导意义，但有一个难点是血浆中ctDNA含量极低，并且二代测序背景噪声很高，肿瘤信号很容易完全淹没在背景噪声中。

各家公司或技术通过富集ctDNA以及降低背景噪声干扰，能很好解决这些难点，将高通量测序背景误差下降1000倍，实现超高测序深度下千分之一低频突变的高精准检出。比如阅尔基因独有的BDA技术，可在基因扩增中改变野生型和突变型的热力学效力，通过对突变的富集，将灵敏度大幅提高。比如吉因加开发的ER-Seq低频纠错分析技术，是吉因加针对高通量ctDNA精准检测开发的一项探针富集及DNA分子标签低频纠错技术。

甲基化

当地时间2020年3月30日，癌症早筛公司GRAIL发布了迄今为止最全面的CCGA（Circulating Cell-free Genome Atlas）项目研究成果。结果表明，GRAIL基于液体活检的cfDNA靶向甲基化分析方法可区分多阶段的50多种癌症，包括缺乏筛查指南的高死亡率癌症和早期癌症，特异性>99%，单一假阳性率<1%。该检测对I–III期癌症的敏感性为43.9％，I–IV期敏感性为54.9％。在检测到癌症信号时，该检测还能以93％的准确度定位癌症的组织起源。同日，该研究成果在Annals of Oncology在线发表，文章题为“Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA”。

片段分析

2020年2月香港中文大学卢煜明教授团队的最新研究构建了cfDNA片段化模型，揭示了有关典型cfDNA片段化的两个主要步骤：（1）DFFB、细胞内DNASE1L3和其他凋亡核酸酶对细胞内DNA片段化；（2）血清DNASE1L3、DNASE1进行细胞外DNA片段化，将cfDNA降解为短T端片段。这一机制定义了完整的细胞DNA如何被剪切成血液中的循环小片段。

2020年7月斯坦福大学的Mohammad Esfahani上周在美国癌症研究协会（AACR）年会上介绍了这种名为EPIC-Seq（Epigenetic Profile Inference from cfDNA Deep Sequencing）的方法。斯坦福大学的研究人员开发出的新方法，通过分析循环游离DNA（cfDNA）的片段化模式来检测癌症。这种方法能够利用健康个体和癌症患者的血浆样本，通过cfDNA的片段化模式来准确预测组织特异性的基因表达，而无需分析真正的突变。

2021年1月Delfi Diagnostics获得1亿美元A轮投资。Delfi Diagnostics利用机器学习和细胞游离DNA全基因组片段化图谱（fragmentomes），创建了一种从血液样本中检测肿瘤的新技术。该技术具有高灵敏度、高特异性，可广泛应用于大型或小型实验室，并可精确定位肿瘤在体内的位置。Delfi Diagnostics应用这一技术平台开发了一系列产品，旨在检测高危个体的特定癌症（如肺癌）并识别个体具有患何种癌症的风险。

多手段结合

现在还有多种手段综合后数据分析后大大提高检出的准确性和检出率。

1）基准医疗

基准医疗是一家采用甲基化高通量测序进行二代测序（NGS）早筛早诊产品开发的公司。基准医疗依托临床试验，积累了多维度动态影像学和临床数据，形成了基准医疗自有的以肺癌早筛早诊和治疗为中心的大数据和人工智能平台。这些数据也为基准医疗一系列围绕肺癌早筛早诊和伴随诊断的产品开发提供了基础。基准医疗将在早前推出的一款核心NGS产品”早期肺结节良恶性辅助诊断产品PulmoSeek”的基础上，推出升级产品PulmoSeek Plus，实现液体活检与早期肺癌筛查（LDCT）影像人工智能的有机组合。

2) 诺辉健康常卫清

体外定性检测人粪便样本中的KRAS基因突变(包括但不区分 G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、 G12C、G13D)、BMP3 和 NDRG4 基因甲基化及血红蛋白，各个指标的检测值通过“KRAS 基因突变及 BMP3/NDRG4 基因甲基化和便隐血联合检测分析软件”计算综合评分，用于对肠镜依从性差的结直肠癌高风险人群的筛查。

3) Thrive Earlier Detection公司

2019年5月31日，Thrive Earlier Detection公司创立即宣布完成1.1亿美元的A轮融资。该公司核心基于CancerSEEK技术开发，致力于将癌症早期诊断整合到常规医疗护理中去。CancerSEEK技术通过对循环肿瘤DNA（ctDNA）中的基因组突变和血浆中与癌症相关的蛋白标志物进行分析，发现8种不同癌症类型中的共同特征。

美国约翰霍普金斯大学的科学家于2018年2月23日在Science发表了研究显示，CancerSEEK能对16个癌症基因突变及10种循环中的蛋白标记浓度进行评估。他们对1005名已被诊断罹患8种常见类型癌症的I-III期患者以及850名健康对照者进行了研究；他们发现，CancerSEEK检测到癌症的敏感性为69-98%，结果取决于癌症类型。该测试的特异性为99%，这意味着健康人出现假阳性结果的可能性非常低。在某些情况下，该检验还能提供癌症组织来源的信息，在过去要做到这一点颇为困难。基于该技术开发的液体活检产品已经获得美国FDA授予的突破性医疗器械认定，用于发现于胰腺癌和卵巢癌相关的基因突变和蛋白生物标志物。目前，它在包含1万名健康志愿者，名为DETECT的前瞻性研究中接受检验。Thrive公司计划进行更多临床试验，获得数据支持监管批准和其它推广活动。

ctDNA精准肿瘤学生物标志物的潜力

研究表明，ctDNA可能由凋亡细胞释放，因此，它只代表了肿瘤细胞的一种特定亚群。尽管如此，ctDNA具有多个优点：

1. 它能够提供对肿瘤基因组的综合描述，因为ctDNA从多个不同肿瘤区域或多个病灶处释放，ctDNA分析可以发现组织活检中无法发现的体细胞突变。

2. 深度测序可以发现肿瘤内异质性和只在部分细胞中出现的基因突变。这通常需要大量的CTCs或者多次组织活检才能获得同样水平的信息。

3. ctDNA可以提供肿瘤大小的信息，从而反映出疾病的发展状态和对疗法的反应。研究发现，在非小细胞肺癌（NSCLC）和高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）中ctDNA的突变等位基因频率（VAF）与肿瘤体积呈线性关系。

4. ctDNA还具备预测预后的价值。例如，在旨在治愈的手术或化疗之后，ctDNA的出现是癌症复发和不良预后的有力标志。它预测癌症复发的能力在结肠癌、卵巢癌、肺癌和乳腺癌患者中都得到了验证。

5. ctDNA分析能够发现肿瘤抗性的标志物，例如，在接受抗EGFR疗法的结直肠癌患者中出现的KRAS突变，以及在乳腺癌患者中的PIK3CA、MED1、或EGFR上VAFs的升高。

这些优点让ctDNA成为精准肿瘤学应用方面前景看好的分析物。然而ctDNA检测也需要克服血浆中ctDNA水平过低，细胞衰老带来基因变异的影响等挑战。

结语

发展液体活检相关检测技术并建立科学合理、能准确检测癌症病程的临床检测体系是研究液体活检技术的关键和重点，也是液体活检技术发展道路上必不可少的阶段。未来三种技术合并使用也许是可能的发展趋势，利用各自优势取长补短，使得癌症早筛早诊、动态监测及预后能够发挥出最大效用。