敲黑板 — 核心生物原材料质量控制利器

随着mRNA药物的兴起，其制备过程所涉及的主要原材料如质粒DNA模板、酶类及底物核苷酸(NTP)、修饰核苷酸、帽类似物等的供应受到密切关注。同时，核苷类本身是生物机体内的重要物质，参与机体多种生物进程，其类似物及衍生物是药物研发的重要部分。另外，用于诊断试剂盒的核心原料如引物、探针类单链寡核苷酸，也是产业链上的关键环节，其质量（尤其是纯度的要求）和批次稳定性被严格监控，这些因素使得DNA、RNA类物质的分析需求迅速升温。

然而，寡核苷酸类物质是由共价连接的核苷和磷酸基团组成的复合分子，其大量的磷酸基团与色谱系统金属表面易形成非特异性吸附，因此在实现优异的回收率和获得良好的色谱峰形上历来面临巨大的挑战。

沃特世Premier系统从色谱柱到分离系统均采用MaxPeak高性能表面(HPS)技术，专为大幅减少金属表面与分析物（例如寡核苷酸、磷酸肽、小分子有机磷酸酯及其它对金属表面表现出很强亲和力的分析物）之间的相互作用而开发。本期精选了两个案例，大家一起来观摩对实际工作的帮助。

 图1. Waters Premier液相色谱系统

请先欣赏采用Premier解决方案分析磷酸腺苷类时灵敏度、回收率、稳定性的表现：

RNA组分包括核酸碱基、核苷以及核苷酸、发⽣修饰的RNA化合物，其分析的挑战还在于这些组分的极性较强，可以使用反相色谱，但常需要离子对试剂来增加保留性，其代价是MS电离能力降低。此外，离⼦对试剂需要很长时间才能在系统中达到平衡，并且分析后可能会在LC中残留。通常，即便使用了离子对试剂，在反相LC⾊谱柱中保留这些分析物仍然很困难。

这时亲水作用液相色谱法(HILIC)可作为强力辅助，其使用MS兼容的流动相和极性固定相，旨在保留极性分析物。HILIC方法可以轻松保留RNA组分，但由于各RNA组分的结构⾮常相似，因此仍然不能实现良好分离。

怎么办？

Premier BEH Z-HILIC给您答案！

沃特世科学家团队使用四种不同的固定相分离13种RNA组分，这些化合物包括RNA核酸碱基、核苷和核苷酸，其结构相似，以往⼀直难以分离，尤其是在50 mm的短色谱柱上。新型Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱拥有独特的选择性，能够利用水、⼄腈和甲酸铵的梯度，通过单次运行实现所有化合物的分离，而其它色谱柱均出现⾄少⼀组共洗脱物。虽然辅助质谱检测器仍然可以检出这些峰，但最好能够分离这些共洗脱组分，以便对这些物质进行更好地积分和表征。实验结果表明，Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱与ACQUITY Premier系统结合使用，可以定量所有核酸碱基、核苷和核苷酸以及磷酸核糖。

图4. 13种RNA组分在四种不同的HILIC固定相上的分离结果，峰标记：1) 尿嘧啶，2) 腺嘌呤，3) 腺苷，4) 尿苷，5) 胞嘧啶，6) 鸟嘌呤，7) 胞苷，8) ⻦苷，9) 单磷酸腺苷，10) 单磷酸尿苷，11) 磷酸核糖，12) 单磷酸胞苷，13) 单磷酸⻦苷

Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱另⼀个优势是可以改善磷酸化化合物的峰形，峰宽和拖尾减少的主要原因在于BEH Z-HILIC固定相中采用的MaxPeak⾼性能表面(HPS)硬件可减少磷酸化化合物与⾊谱柱金属表面之间的次级相互作用，而这种相互作用在某些条件下是导致峰形差异、甚⾄样品损失的根源。

质粒是小分⼦环状双链DNA，近年来越来越多地用于疫苗和基因疗法的生产。生产的质粒DNA主要为超螺旋形式，但由于⽣物工艺过程中发生构象变化，导致也会存在其它如开环和线性形式的质粒。这些亚型与其它亚型因其可能会影响产品的有效性或安全性均被视为质粒杂质。FDA指导原则建议，超螺旋形式的质粒纯度应⾼于80%。为保证⾼纯度和⾼质量，⾏业对超螺旋质粒纯度⽔平的预期通常高于90%。因此，可靠地测量质粒亚型的相对丰度对于确保批处理、配制和储存⼀致性⾄关重要。

图5.质粒的主要亚型图示

阴离子交换色谱法(AEX)是⼀种稳定、可重现、易于自动化的分析技术，且只需少量样品。虽已⼴泛用于质粒纯化制备，但它作为⼀种分析技术，在分离和定量质粒亚型方面具有⾮常大的潜力，可提供⼀种简单、稳定的质粒纯度检测方法。另外，质粒DNA与色谱柱的季铵键合相之间牢固的结合强度，有利于分析低纯度裂解物中的质粒，而无需额外的样品净化步骤或使用DNA特异性染料。由于质粒DNA因骨架上的磷酸基团而带负电荷，因此AEX联合Premier系统是用于质粒相关分离和分析的理想选择。不同质粒亚型在形状和构象上存在差异，AEX利用带正电荷的固定相与质粒DNA骨架上带负电荷的磷酸基团之间的相互作用将其分离。尽管不同亚型的总体分⼦量和电荷相似，但它们的局部电荷密度因构象不同而存在差异。因此，这些亚型可以在AEX色谱柱上得到分离，如下图所示。

图6. ΦX174质粒亚型在Waters Protein-Pak Hi Res Q⾊谱柱上的分离

沃特世科学家团队开发的这种使用Waters Protein-Pak Hi Res Q强阴离子交换色谱柱分离超螺旋、开环和线性形式的5.4 kbp质粒的分析方法，在约117-1875 ng的总载样量范围内，三种主要质粒形式的相对定量结果⼀致。

图7.三种亚型（即超螺旋、开环和线性形式）的出色线性。

从以上两个案例可以看到Premier解决方案对生物原材料的高难度分离和定量挑战都能够轻松化解，而且无需耗时的系统活化即可获得清晰可靠的结果，将对金属敏感化合物可能造成的分析风险降到尽可能低，这对持续改善工艺、设置质量控制关卡，大有裨益。看到这里，是否对小编的分享产生了浓厚的兴趣？ 快动动手指，来书写您与Premier的缘分故事吧！