重组抗体药物的质量控制

重组抗体药物的质量控制

重组抗体药物是生物工程关键技术的前沿成果，在肿瘤、自身免疫、器官移植和感染性疾病的治疗中均取得了显著疗效，在生物技术药物市场中的比重也在迅速攀升。作为生物技术产业化领域最成功的产品之一，如何通过质量控制确保抗体药物的安全有效一直是本领域的关注热点。

标准物质和检测方法是抗体药物质量控制的两个重要技术支撑点，而性质稳定均一的标准物质是方法学建立中必不可少的重要因素。包括抗体在内的生物大分子的结构决定其功能，因此其质控标准物质也包括理化对照品及活性标准品。

理化对照品结构的全面鉴定一般包括质谱相对分子质量测定、末端氨基酸序列测定、液质肽图或肽指纹图谱分析、二硫键配对方式以及代表翻译后修饰的糖基化分析等。

1 质谱相对分子质量测定

抗体由 4 条肽链组成，且 Fc 段具有糖基化修饰，可直接测定完整抗体的相对分子质量，也可以用糖苷酶切除糖基后再测定抗体蛋白部分的相对分子质量，或者以还原剂将二硫键打开后分别测定抗体轻、重链相对分子质量。目前质谱相对分子质量测定主要采用电喷雾离子化 ( electrospray ionization，ESI)及基质辅助激光解析离子化(matrix-assisted la-ser desorption ionization，MALDI) 等离子源。蛋白离子化后，通过质量分析器测定其质荷比计算相对分子质量，并与理论相对分子质量进行比较，以初步验证抗体结构是否正常。

2 末端氨基酸序列测定

末端氨基酸序列测定也是抗体一级结构鉴定的方式之一。通常 N-末端氨基酸测定以 Edman 降解法最为常用。由于抗体的特殊结构，测序时须首先将二硫键还原，并以适当的方法将轻、重链分离后再测定。如果抗体的 N-末端存在封闭，则需针对封闭类型，采用相应方法去封闭后再按上述程序进行测定。

目前 C-末端氨基酸序列测定可采用酶法或化学法收集 C-末端肽后，再以 N-末端测序方法进行;也可以直接对收集的 C-末端肽段进行串联质谱分析。此外，还可通过质谱仪测定被羧肽酶酶解后获得的 C-末端长短不一肽段的相对分子质量，并根据相邻相对分子质量的差值确定 C-末端序列。

3 液质肽图或肽质量指纹图谱分析

为了进一步鉴定重组抗体的一级结构，可进行液质肽图或肽质量指纹图谱分析。液质肽图是将抗体用蛋白酶酶解为肽段后，先经色谱分离后再以质谱检测，通过相对分子质量测定结果与蛋白酶酶解特性的综合分析来确定各肽段的序列。而将酶解所得肽段直接进行质谱检测则称为肽质量指纹图谱。液质肽图的优势在于各肽段经过液相分离后，在质谱相对分子质量测定时相互之间的干扰较弱，但耗时较长;而后者则适宜高通量分析。

4  二硫键分析

IgG1 型抗体中，共有 16 条二硫键，正确配对的链内、链间二硫键是维持重组抗体空间结构和发挥生物学功能的重要保障。二硫键的确定方式可采用液质肽图或肽质量指纹图谱法。即在非还原条件下，将重组抗体直接进行蛋白酶酶切，酶切后有些肽段仍通过二硫键连接在一起，通过对这些肽段进行质谱鉴定即可验证抗体的二硫键配对方式。为确保抗体的完全酶解，必要时可分别采用两种或以上的蛋白酶进行酶切，并通过综合分析对抗体二硫键配对的方式进行鉴定。

5 糖基化分析

糖链在维持抗体正常结构及与其他蛋白的相互作用中均发挥了重要作用，抗体 Fc 段的糖链改造可显著改变其生物学活性。因此在抗体的质量控制中，翻译后糖基化修饰的分析是十分必要的。目前主要包括寡糖图谱、糖基化位点分析及糖链结构分析等。

寡糖图谱是对重组抗体药物中不同修饰形式的寡糖链所占比例的分析。即将糖苷酶从抗体上切下的糖链衍生、纯化后，再以液相色谱分析确定各寡糖链所占的比例。寡糖多样性形式的进一步分析，可结合文献资料并采用相应的寡糖参考品进行综合比对。

抗体的糖基化主要有 N-糖与 O-糖两种，位于N-糖还原端的 N-乙酰葡糖胺(GlcNAc) 与抗体中的天冬酰胺(Asn) 的酰胺氮以 β1，4 糖苷键相连，且糖基化位点处有特殊的序列子结构“Asn-X-Ser/Thr”，其中“X”为除脯氨酸(Pro) 外的任意氨基酸，只有该序列子中的 Asn 才有可能发生 N-糖基化。O-糖虽无特殊序列子结构，但可与抗体中丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr) 的羟基相连。糖基化位点可通过切除糖链前、后的液质肽图或肽质量指纹图谱的方法确定，通过对图谱中相对分子质量的差异肽段进行分析，即可确定糖基化位点。

糖链结构分析目前有多种方法:可通过测定糖链的相对分子质量结合已有的文献资料对糖链结构进行预测;也可通过串联质谱的方法测定糖链结构;或结合多种糖苷酶对糖链进行分步酶切测定单糖的连接方式等。

重组抗体产品的质量控制根据相关法规、指导原则的要求及产品自身特性，其原液检定主要包括各种理化分析、活性测定、残留杂质分析等，成品除包括含量与活性测定外，还需要对安全性和注射剂的常规项目进行质控。

1  理化分析

抗体药物批检验的常规质控中，针对结构的理化分析主要包括 N-末端氨基酸序列、肽图、糖基化分析等测定等，并通过引入已全面分析的理化对照品进行比对，因此在常规批检验质控中，将简化结构鉴定的工作量。N-末端氨基酸测定同理化对照品。在肽图分析中，由于抗体的空间结构复杂、紧密，导致蛋白酶酶解的效果不理想，因此在蛋白酶酶解前，一般先采用化学或物理方法将抗体变性后，再以二硫苏糖醇等还原剂打开二硫键，并对还原后的游离巯基进行烷基化保护，按上述相同条件制备的样品与理化对照品酶解将更完全，同时后续的 HPLC 分离也将获得较理想肽图。为避免糖链对肽图测定的影响，有时还需要在酶解前先将其切除。糖基化分析根据抗体药物自身的理化特性，结合理化对照品并通过唾液酸含量、寡糖图谱分析等方式进行控制，并可依据供试品唾液酸、各寡糖峰面积与对照品的相应比例进行判定。通过 N-末端氨基酸序列、肽图、糖基化分析等测定，结合与理化对照品的比对，可以有效确保生产工艺的稳定及抗体药物的批间一致。

抗体药物的纯度直接反应了纯化工艺水平及产品质量的优劣。为避免一种检测方法在蛋白纯度检测中的偏差，一般选用至少两种不同原理的方法进行检测，以尽可能地分离相关杂质并得到相对准确的纯度结果。测定抗体纯度的常用方法包括 SDS-PAGE 法及毛细管电泳等方法，以及反相、分子排阻和离子交换等高效液相色谱法。还原型 SDS-PAGE电泳是较常用的方法，标准一般规定轻、重链条带含量之和≥95． 0% 。液相色谱法进行纯度测定时应选择合适的色谱柱及流动相，避免在分析过程中抗体蛋白沉淀挂柱;在正式分析之前应充分平衡色谱柱并做空白对照，空白对照中应无杂峰出现;按面积归一化法计算主峰面积，一般不应低于总面积的 95． 0% 。

蛋白含量测定目前常用的方法主要包括分光光度法、Lowry 法、Bradford 法、BCA 法、凯氏定氮法等。除凯氏定氮法以外，其余方法的原理均与蛋白结构和氨基酸组成相关，并且所需含量测定对照品要和供试品一致。目前绝大多数重组抗体的含量测定采用的是分光光度法。其消光系数是根据 Edel-hoch 研究建立的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸模型化合物在 6 mol·L－1盐酸胍条件下，可被用于同等变性条件下对其他非折叠蛋白消光系数进行估算的原理所确定。结合该变性消光系数，再通过与不同浓度天然蛋白、变性蛋白吸光值的校正计算即可获得该目标蛋白的消光系数，但该消光系数是通过模型化合物以及与变性蛋白的比对分析估算获得。目前国外生物技术产品含量测定中，已多采用与供试品具有相同结构的标准物质进行含量测定，但均无公开的含量溯源资料。凯氏定氮通过含氮量分析进行蛋白含量测定，反应中消耗的标准酸滴定液可溯源至恒重无水碳酸钠的重量，因此无需其他蛋白标准物质，可作为含量标准品溯源的方法，同时氨基酸组成分析也是可供选择的手段之一。

此类质控主要包括相对分子质量和等电点等指标。相对分子质量也主要采用还原型 SDS-PAGE 电泳的方法，标准一般规定为理论相对分子质量 ±10%以内，并通过与理化对照的迁移率进行校正。等电聚焦电泳是重组抗体等电点测定的常用方法，其 pH 梯度主要由两性电解质建立。由于溶媒中存在的盐会破坏 pH 梯度，因此可采用透析、超滤、过柱等方法进行脱盐。测定重组抗体的等电点时，由于其糖基化的不均一使抗体所带电荷不同，测定结果中会出现多个电泳条带，因此重组抗体的等电点测定结果通常为一个 pH 范围，并且应与已全面分析的理化对照品一致。

2 生物学活性

生物学活性测定是确保重组抗体有效性的重要质控指标。抗体与其特异的靶点结合后，通过细胞因子信号的阻断、补体系统的活化、耦联毒素杀伤等生物学作用发挥重组抗体的治疗功效，其生物学活性测定主要是在体外建立相应的细胞评价模型，模拟其作用机制产生客观的全程量效反应，并通过与活性标准品的比较对其生物学活性进行评价。根据其作用机制主要分为补体依赖的细胞毒法、细胞/生长因子信号通路阻断后产生的杀伤活性中和或细胞增殖抑制法、报告基因测定等方法。如无法建立特异的细胞学量效反应模型，也可以测定重组抗体与其作用靶点的结合能力作为其功能性的评价指标，主要测定方法包括 ELISA 法、流式细胞仪法和基于表面等离子共振技术 ( surface plasmon resonance，SPR)的生物分子相互作用分析法(biomolecular in-teraction analysis，BIA)等