Gastroenterology (IF 22)：南京鼓楼医院/乌尔姆大学/慕尼黑工业大学合作发现胰腺导管腺癌研究新突破

胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）预后差，胰腺导管腺癌胰腺炎是PDAC发生的重要危险因素。由于通常PDAC诊断时已为晚期，深入理解PDAC早期的发生和转化过程可以促进诊断标记物的开发和早期干预。由于成熟的胰腺腺泡细胞的高度可塑性，在致癌KRAS突变和急性或慢性炎症存在的情况下，腺泡细胞会发生腺泡-导管化生(acinar-to-ductal metaplasia, ADM)，部分ADM病变可进一步发展为胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)。AGR2编码内质网相关的二硫键异构酶，在PDAC早期发生中表达增加，被报道具有P53抑制作用，具体机制不详。

近日，南京大学医学院附属鼓楼医院消化科团队和德国乌尔姆大学胰腺外科团队合作在国际学术期刊《Gastroenterology》（2021 IF=22.682）上发表题为“AGR2-dependent nuclear import of RNA polymerase II constitutes a specific target of pancreatic ductal adenocarcinoma in the context of wild-type p53”的文章，发现AGR2蛋白通过调控RNAPII入核，抑制PDAC发生早期ADM病变中ATR依赖的P53激活，基于此合成的六肽可以抑制ADM-PanIN转化，增加P53野生型PDAC的化疗敏感性。

利用蛙皮素诱导的急性胰腺炎模型可以加速KRAS驱动的胰腺癌致癌过程，该课题组在之前的研究中发现当不存在KRAS突变时，野生型（WT）小鼠在诱导急性胰腺炎经历3个不同的阶段：炎症期、再生期、转归期。而相较于野生型小鼠，在p48^Cre/+; LSL-Kras^G12D/+ (KC)小鼠中，蛙皮素诱导的ADM过程是不可逆的，逐步进展为PanIN。为了识别潜在的调控信号，课题组分析了炎症期WT小鼠和KC小鼠相对于未处理组的转录组差异，发现Agr2在KC小鼠诱导过程中发生明显上调。

Agr2基因编码一种可抑制p53激活的致癌蛋白，我们发现在KC小鼠胰腺的再生期中，p53表达短暂被抑制。因此我们假设Agr2可能通过抑制p53活性调控腺泡细胞再生和ADM-PanIN转化。

图1. AGR2在KRAS诱导的ADM-PanIN转化中被诱导激活

为了验证上述假设，我们使用胰腺特异性敲除Agr2的转基因小鼠p48^Cre/+; LSL-Kras^G12D/+; Agr2^flox/flox (KC; Agr2^-/-)，发现敲除Agr2后PanIN病变的形成明显减少，P53阳性ADM病变的形成明显增加。Western blot分析发现，Agr2缺失可以特异性增加p53的磷酸化水平，DNA损伤的标记物p-H2ax^S139也明显增加。

图2. AGR2缺失在PDAC早期癌症发展过程中阻断ADM-PanIN转化

通过比对蛙皮素处理96小时后KC小鼠和KC; Agr2^-/-小鼠胰腺组织的转录谱数据，发现437个差异表达的转录本，包括p53 (FDR<0.01)，另外有48个基因与p53表达相关。Gene Ontology (GO)富集分析显示，这48个转录本与RNA聚合酶II (RNAPII)介导的DNA结合密切相关。进一步通过在多种细胞中敲减Agr2发现RNAPII的最大亚基Polr2a的磷酸化水平明显下降，并且在P53野生型的细胞株中，P53的磷酸化水平也发生下调。

图3. Agr2 的缺失通过失活RNAPII诱导 p53

RNAPII需要完成装配和导入细胞核，并在低磷酸化状态下被招募到基因启动子上，进一步被CDK7和CDK9(周期蛋白依赖性激酶7和9)依次磷酸化，以促进转录。由于RNAPII亚基中不包含核定位信号(NLS)，因此在真核细胞中需要额外的含NLS的因子来介导其核导入。Agr2在c端包含一个NLS序列，并且人和小鼠的AGR2蛋白均包含Tx[IL][YF][YF]的肽结合位点共识，该位点允许Polr2a与Agr2结合。并且我们在人源和鼠源细胞中验证了Polr2a需要AGR2的NLS介导其核导入。

图4. Agr2 通过其 C 端NLS介导RNAPII的核输入

根据Polr2a的蛋白质序列，我们设计了一个六肽NTAIYY来阻断Agr2与Polr2a结合，Y-A突变肽段NTAIYA作为阴性对照，使用脂质体包裹。在人和小鼠来源的多株胰腺癌细胞中CoIP实验证实NTAIYY可以剂量依赖性地抑制Agr2与Polr2a结合，并且可以减少细胞核内的POLR2A水平。在P53野生型的胰腺癌细胞系中，NTAIYY可以有效诱导ATR依赖的P53激活。RNA测序发现HPAC细胞在NTAIYY处理后，RNAPII活性相关的通路 “RNAPII transcription regulator complex”和 “transcription regulator complex” 显著下调，DNA修复相关通路显著上调。在KC小鼠来源的类器官模型中，我们也验证了上述结论。

图5. 脂质体载肽阻断RNAPII核输入抑制Kras介导的胰腺癌发生

据报道，约三分之一的PDAC是P53野生型。使用NTAIYY和RNAPII的抑制剂α-amanitin联用可以有效增加对P53野生型肿瘤细胞和类器官的杀伤效果，并诱导P53的激活和凋亡增加。并且多肽也可以有效增加胰腺癌常用化疗药物5-FU，伊立替康，奥沙利铂和紫杉醇对P53野生型胰腺癌的敏感性。

图6. 载有 NTAIYY 的脂质体可作为p53野生型PDAC 的有效药剂

本文中CRISPR/Cas9 AGR2基因敲除慢病毒（GV392，单载体）及突变型表达质粒（POLR2A^Y1177A、AGR2^ΔNLS、AGR2^ΔSP ）均由吉凯基因提供。CRISPR/Cas9 AGR2 KO慢病毒感染Capan2 和 HPAC 细胞，WB检测AGR2、p-POLR2AS2/5 和 POLR2A 的表达水平，结果显示AGR2被敲除（图7G）；同时，使用Sanger 测序进一步验证，结果显示AGR2被成功敲除（图7H）。

图7. CRISPR/Cas9 AGR2 KO 慢病毒感染Capan2 和 HPAC 细胞，WB和Sanger测序显示AGR2被成功敲除

本文通讯作者为南京大学医学院附属鼓楼医院/德国乌尔姆大学孔波教授。德国慕尼黑工业大学张志恒博士和南京大学医学院附属鼓楼医院/德国乌尔姆大学李洪祯博士为共同第一作者。   

该文章一作李洪祯博士将于2022年1月6日在吉凯基因B站直播间为大家分享《诺奖CRISPR/Cas9 在肿瘤基因调控机制研究中的应用》，欢迎大家前来观看！