蛋白核酸互作「RNA pull down实验」，和你想的一样简单吗？！

RNA 涉及生命的所有领域，在许多基因表达过程、宿主防御机制、细胞增殖和疾病中发挥着关键作用。RNA生物学领域的研究需要重点阐明RNA-蛋白质网络的空间和时间动态，尤其对当下热门的lncRNA、circRNA研究更是如此。

RNA pull down是一种流行的以 RNA 为中心研究RNA-蛋白质相互作用的方法。用于分离RNA 结合蛋白复合物的方法可分为两大类：体外和体内纯化策略。迄今为止，大多数已知的RNA-蛋白质相互作用已使用体外RNA 下拉分析确定。RNP 复合物的体外重组采用了各种 RNA 标记策略，例如共价连接、生物素标记或适体，确保目标RNA 固定在固体上支持。

( 1 ) RNA可以共价连接到固体支持物上。( 2 )体外合成或转录后的RNA经过生物素标记并经链霉亲和素磁珠下拉。( 3) 天然或人工适体可以共转录连接到RNA，通过适体-配体相互作用绑定固定。( 4 )用反义寡核苷酸分离，结合各种珠子。

上述RNA与细胞提取物孵育组装为核糖核蛋白复合物（RNP），通过磁珠等方式将带有相关蛋白质的RNA 下拉并洗涤以去除非特异性结合的蛋白质。然后通过洗脱获得蛋白质，并通过 SDS-PAGE 进行分离，再以质谱或者western blot分析。

但这些复合物可能并不代表真正的 RNA-蛋白质复合物，因为固定化的 RNA 可能无法正确折叠，并且在纯化过程中会形成非特异性 RNA-蛋白质相互作用。这些方法也无法分析因响应环境条件而形成的瞬时RNA-蛋白质相互作用。

为了克服体外RNA 纯化方法的局限性，捕获活细胞中存在的RNP，以期获得更具生理相关性的蛋白质复合物，下面介绍常用的两种方法：

生物素-链霉亲和素相互作用是已知最强的非共价生物相互作用之一，可以承受多种缓冲条件，包括不同的盐浓度、热量、pH 值和蛋白水解条件，这种方法非常灵敏，需要的时间更少，易于使用，并且具有成本效益。化学合成或体外转录 RNA 用生物素标记，并与总蛋白提取物一起孵育，是当前RNA pull down的最常用方法，但生物素标记孵育时间、效率会受RNA长度、结构影响，另一个不足是生物素是细胞中许多羧化酶（例如丙酮酸羧化酶）的辅助因子，因此直接结合生物素的蛋白质可能会出现假阳性。

对于内源性 RNA 下拉，不直接对RNA进行生物素化，而是根据目标 RNA 序列设计 20-90nt 生物素化 RNA 探针，然后与链霉亲和素琼脂糖珠和细胞提取物一起孵育。天然或交联条件可用于内源性 RNA下拉。

此方法适用于难以用外源表达构建转染的细胞（如lncRNA长度超出构建范畴），理论上可以分离任何感兴趣的内源 RNA。但该方法的不足是，由于 RNA存在二级结构，反义寡核苷酸可能无法结合某些 RNA 序列，因此，探针的设计和验证是一个具有挑战性和耗时的步骤；此外，该方法适合分离高丰度的 RNP。

探针设计很麻烦，还得找专门公司定制，又对细胞本底的RNP丰度有要求，因此，类似于应用体外转录，表达出高丰度的RNA，将RNA在细胞进行内源性表达，并类似编码基因那样，连接通用型标签（如flag，6his）进行下拉岂不更好。只不过，适用于RNA的标签是非编码的，典型的就是MS2。

MS2 适配体是源自 MS2 RNA 噬菌体的19核苷酸 RNA 发夹结构，噬菌体 MS2 外壳蛋白与 MS2 RNA 发夹适配体具有高度特异性和亲和力，利用这种强相互作用，多个串联重复序列（通常运行 6-8 个适体）被整合到目标 RNA 的 3'' 端，由载体在细胞转录出；此外MS2 外壳蛋白通过与特定磁珠标签融合（如GST标签，借由GST pull dwon试剂盒下拉）单独构建一个载体，在细胞共转两个载体，然后获取细胞提取物，并进行下拉实验具体实验步骤见<< Identification of mRNA-interacting factors by MS2-TRAP (MS2-tagged RNA affinity purification) >>

MS2下拉法原理简单，省去了探针设计之痛，但是需要注意调整质粒用量以及双系统的转染摩尔比，以防RNA表达过多产生非特异性、非生理性的结合。

本文我们介绍了两种常用的内源RNA下拉法，体内策略的优点是细胞内RNA-蛋白质交联的应用，它可以用于“冻结”生理性 RNA-蛋白质复合物并保持细胞内的瞬时蛋白质-RNA 相互作用。当然，每种策略都有优缺点，需要根据RNP的特征选择合适的方案。吉凯基因长期致力于各分子互作的研究，有需要的老师，赶紧咨询吧！！！

【参考文献】

1.Current approaches for RNA-labelling to identify RNA-binding proteins

2.Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases

3.Identification of mRNA-interacting factors by MS2-TRAP (MS2-tagged RNA affinity purification)