【微学堂】一招搞定核酸和蛋白定量检测（内有操作视频）

核酸和蛋白质简介

Watson  和 Crick  于 1953  年创立了 DNA  双螺旋结构模型，是一项具有划时代意义的工作，加深了人们对核酸的认识。而蛋白质则是另一种生命体的重要成分，一般来说，蛋白质约占人体全部质量的 18% ，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者，氨基酸是蛋白质的基本组成单位，蛋白质的种类很多，性质、功能不同，它具有一级、二级、三级、四级结构，其结构决定了功能。1838  年荷兰科学家格利特·马尔德发现了蛋白质。

核酸及蛋白质的定量是遗传学和分子生物学中许多复杂实验上游的基本检测方法。拿 DNA 检测举例， DNA  测序、 PCR /  qPCR 、克隆 / 转染、 DNA  微阵列实验等几乎所有关于  DNA  的应用都会在操作流程的某个环节中涉及到  DNA  纯度，浓度的检测。各种方法被开发出来用于定量这些生物学成分，对于核酸检测，最常见的手段仍然是紫外分光光度法，其次是荧光法；对于蛋白检测，最常见的手段则是比色法，也可以被认为是可见分光光度法，其次是荧光法。

核酸和蛋白质定量检测的方法

紫外分光光度法的原理是每个核酸分子在紫外波长范围内有光吸收，在已知核酸样本的消光系数和光径时可通过朗伯-比尔定律 A = εcL （吸光度  A 等于被测分子的摩尔消光系数  ε  乘以浓度  c  和光径  L ）计算浓度，此方法是一个非常稳定的技术，其基本原理自诞生以来一直没有太大的改变。为了计算核酸浓度，在  260  nm  处测量样品，并在  230  nm  和  280  nm  波长处进行辅助测量，以检查样品纯度。蛋白样品也可以使用紫外分光光度法进行定量，然而，更准确的则是比色法。紫外分光光度法利用酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的芳香性质在 280 nm  处有光吸收，但酪氨酸和色氨酸含量在不同待测蛋白中差异较大时，计算的浓度会有一定的误差。比色法定量检测蛋白浓度是目前最为常用的蛋白浓度测定手段，一般是通过蛋白与相关试剂反应后产生有色物质，而有色物质的颜色深浅也就是吸光值大小与蛋白浓度成正比，利用具有浓度梯度的系列蛋白标准品与试剂反应后的吸光值所生成的标准曲线计算出被测蛋白样品浓度。常用的比色法包括 Bradford  法、 BCA  法、 Lowry  法等，例如，二喹啉甲酸 ( BCA ) 蛋白实验可以不依赖氨基酸序列和长度测定蛋白浓度，该实验利用铜基双缩脲反应，其中氨基酸主干在碱性环境中与铜分子形成有色螯合复合物。

荧光法和光吸收法相比，有许多天然优势，如可以同时进行多种荧光染料标记、高特异性和高灵敏度，用荧光染料检测核酸和蛋白浓度是基于其与核酸分子或蛋白分子结合后可发射出强烈荧光且信号强度与结合的核酸或蛋白分子数成正比，通过检测浓度梯度标准品的荧光强度绘制标准曲线，进而计算出待测样品浓度。比较有代表性的核酸检测荧光试剂如 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay 专门特异性结合并检测双链 DNA 浓度， Quant-iT OliGreen  ssDNA Assay 用于特异性检测单链 DNA 浓度，而 Quant-iT RiboGreen RNA Assay 则是特异性检测RNA浓度的试剂；NanoOrange 是荧光法检测蛋白浓度的代表试剂之一，信号稳定时间也较长。

用酶标仪进行核酸和蛋白质定量检测

*视频时长：19’12”

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