2021 AutoChrom期末论述题样本

ACDLabs CN

2022.1.04

作者 ACD

TA的动态

论述题样本

ACD AutoChrom 2021年末考试

请根据以下化合物以及pH-logD图形写出一个方法开发的计划。注意：化合物1和4的logD有重叠。

南京百泽医药科技有限公司——王贤

化合物2的pKa预测结果：

化合物5的pKa预测结果：

理论分析

根据ACD软件对6个目标分子logD和pKa进行预测，对6个目标物进行分析，具体如下：

ID2是芳香胺，呈弱碱性，pKa在约3.6~5.2之间，pH≤3.5时，logD小于0，但最小logD也在-1.3左右；pH≥3.5时，logD大于0；低pH主要以质子化碱存在，中、高pH主要以分子型存在，该化合物反相上的保留没有太大问题；

ID5的N上呈弱酸性，pKa在约9.7~10.5之间，pH≤9.1时，logD大于0；pH≥9.1时，logD小于0，但最小logD也在-1.3左右；低、中pH主要以分子型存在，高pH主要以离子型存在，在常规反相上的保留也没有太大问题；

ID1、ID3、ID4、ID6在pH1~12之间无明显的酸碱性，logD均大于0，常规反相保留更没有问题；

色谱柱筛选

根据上述分析发现，ID1和ID4的logD曲线几乎重叠，说明想完全通过疏水性的差异来分离不太可能，根据logɑ=log(k/kEB)=ȠH-δS+βA+ɑB+κC这个经典的经验公式，我们可以考虑除了疏水性以外的其他作用力，比如氢键、空间位阻、π-π作用力大小差异等来进行分离，但上述经验公式并未包含π-π键的作用力，而K.Croes, A. Steffens, D.H Marchand, L.R. Snyder等人在J.Chromatogr. A 1098 (2005)123-130发表的文献中总结了新的经验公式对上述公式进行了补充，增加了π-π键和偶极-偶极作用力的说明，公式如下：

logɑ=log(k/kEB)=ȠH-δS+βA+ɑB+κC+πP+μD

当P>0时，发生在苯基柱和氰基柱上（π-π键作用力）；

当D>0时，仅发生在氰基柱上；

当P和D=0时，发生在其他色谱柱上。

而能满足以上分离要求的色谱柱我们首先想到的是苯基键合的色谱柱（如PFP、C18-PFP、BIPFP、Biphenyl等色谱柱），当然也可以对比以氢键作用分离为主的镶嵌型色谱柱Bonus RP或Shield RP或SB-AQ柱等。

流动相A的选择

根据上述分析，可以选择10~20mmol/LKH2PO4缓冲液（pH=6.8左右）或0.1%TFA或0.1%高氯酸（使用低pH体系加离子对或离液剂主要为了化合物2的峰型）作为流动相A。

有机相种类和比例筛选

上述多个化合物含有多个-F、-NH2、C=O、-NH-，含有丰富的氢键作用位点，那么甲醇作为氢质子供体必然是很友好的有机相，而乙腈同样能在色谱柱及化合物之间产生或抑制π-π键的作用，也会产生不一样的选择性差异，所以甲醇和乙腈的对比，以及二者的混合比例筛选是我们可以考虑的一个因素（采用甲醇时需要关注化合物5的稳定性情况）。当然也可以加入少量四氢呋喃也是异构体分离改善的很好的调节剂（使用THF因有抗氧剂，需要注意新开瓶，也需要关注基线和压力的波动情况）。

色谱柱和流动相的前期筛选可以借助多功能的方法开发系统结合ACD的软件设计多组不同组合的实验，对数据结果进行评估，选出关键的方法参数再做进一步的模拟和优化。（其中甲醇乙腈的不同比例也可以设计二元混合有机相比例单因素试验，快速寻找合适的有机相种类和比例）。

梯度和柱温的筛选

柱温和梯度对结构类似物的分离也很重要，可以设计温度（logk=logA+B/Tk）、梯度（logk=logkw-φS）、有机相比例筛选的3因素2*3*3的实验，借助ACD LC Simulator，在三维空间中寻找合适方法并探究耐用性空间。

波长的筛选

根据各化合物的最大吸收波长以及各杂质和主成分在不同波长之间的校正因子测定结果，并综合考虑不同波长杂质检出量和检出个数等进行选择。

7、溶剂的筛选

综合考虑各杂质和主成分的溶解情况以及溶液的稳定性情况，能使用流动相起始比例溶解最好，可以有效避免溶剂效应，如不能用流动相尽量选择惰性溶剂乙腈和水的低有机相混合溶剂等，根据稳定性情况考虑是否需要采用进样器控温。

8、供试品浓度和进样量的选择

应以稀释后能达到各杂质至少0.05%的报告限为定量限的水平为准进行选择，并根据溶剂和流动相的匹配度选择无溶剂效应风险的进样量即可。

9、耐用性和预验证考察

根据以上各方法参数的筛选结果，对方法耐用性（包括不同品牌仪器、不同批号色谱柱、不同流速等进行考察），对关键预验证项（强制破坏样品的专属性考察、LOQ、LOD、杂质贮备液和供试品溶液以及加标供试品溶液稳定性、回收率、线性和重复性等进行初步考察），确定方法没有风险点，否则需要再回到前面的某个筛选项再次优化。

10、起草方法开发报告和申请正式验证方案。

根据以上结果整理开发报告，并申领正式验证方案，如验证过程再次出现风险点，展开调查后重新开发。

湖北生物医药产业技术研究院有限公司(武汉人福)——胡慧

根据上述对各化合物pH-logD曲线的预测,可以看出,化合物2在酸性(低于PH3.7)条件下logD值为负值,可能选择常规C18色谱柱保留较弱,化合物5在pH值大于8时保留较弱,为了让各化合物在常规C18色谱柱上均有所保留,可以初步选在pH3.5到8.0之间的范围做初步筛选。

从各化合物在pH3.5到pH8.0范围内的logD曲线分析,发现化合物1和化合物4logD值重叠,可能存在分离困难的问题。

通过各化合物的结构特性,化合物1、3、4、5、6结构中均含有连苯环的酰胺键,化合物的碱性pKa值约为13;各化合物可能存在化合物峰形拖尾的问题,且各结构中存在位置异构体,可考虑选择五氟苯基柱、CSH色谱柱进行初步开发;

优化化合物1和化合物4可能较难分离,流动相选择时可以考虑选择流动相中含有甲醇或其他对F上孤对电子有作用的溶剂;增强分离作用

在梯度设计上,可以考虑如下:梯度1:0-10分钟;10%有机相-80%有机相(考虑各化合物的保留,有机相不需要达到90%应该能够全洗脱);梯度2:0-20分钟;10%有机相-80%有机相;梯度3:0-30分钟:10%有机相-80%有机相;

此化合物在波长均有紫外吸收,不存在波长难以选择的问题,可以根据各化合物杂质紫外吸收波长,结合校正因子,杂质检出个数做出合理选择;流速和柱温暂不作为关键考虑项,选择常规参数即可。

根据上述判断,采用UPLC上柱筛选进行筛选,基本一晚上能够得到所有设计的结果;根据筛选的结果再进一步判断分析。

武汉嘉诺康医药技术有限公司——徐甜

知识空间分析