采访来自南加州大学转化成像中心生物医学工程学院分子与计算生物学系 Francesco Cutrale 博士和 Scott E. Fraser 博士
之所以开发将高光谱拆分（hyperspectral unmixing）与相量分析（phasor analysis）相结合的技术，是为了简化多色成像的过程。这种组合方法可解决多通道成像中常见的问题，例如荧光团串扰和低效的序列成像（这两种情况都可能导致丢失信息）。此外，它还有助于改进图像采集和数据生成，从而提高实验效率。
我们采访了这项技术的开发者 Fraser 教授和 Cutrale 博士，希望更深入地了解这种方法及其为日常显微成像研究工作带来的潜在益处。
亲爱的 Francesco 和 Scott，非常感谢你们今天来到这里并回答我们的问题。你们能否详细介绍一下如何将高光谱成像与相量分析相结合，以简化多色成像的过程？你们两位都是这些领域的专家，或许我们可以先稍微介绍一下这两种技术。
Cutrale 博士：高光谱（hyperspectral imaging）成像技术已问世一段时间，因为它最初是为遥感而开发的。例如在陆地上飞行的飞机，或环绕地球的卫星。当您查看彩色图像时，如果观察它们的光谱组成，会发现它们可能非常不同。高光谱成像增加了一个新的成像维度，即波长。在高光谱成像中，我们不是在各个通道中依次捕获单色图像，而是同时采集具有大量通道的图像。二十年前，Scott 已经在显微镜上采用了这种高光谱探测方法 ，但是他所用的方法在进行拆分时涉及许多复杂的数学运算，这意味着需要区分哪些组分来自样本中的哪种信号。当时的标准算法是以卫星和遥感成像为中心开发的，因此在这种情况下，光源是太阳。它比显微成像中的信号强得多，显微成像的荧光中的信噪比非常低。成像会受噪声、速度和光子预算限制的影响。
你们如何克服了这些显微成像特有的障碍？
Cutrale 博士：要获取这种信息，必须找到一种能够克服上述各种噪声的可靠算法，它不仅要能非常简单地描述单个像素（因为它可能确实会受噪声影响），而且也要能让人简单地了解整个样本的整个光谱组成。这正是相量分析（phasor analysis）所起的作用。相量分析技术已面世几十年，在荧光寿命成像（FLIM）领域已经非常成熟。在STELLARIS 8 FALCON 共聚焦系统这一出色的仪器中，徕卡将荧光寿命成像与相量分析相结合。相量分析在荧光寿命成像中意义重大，因为这些只是质量和频率域的原始信号。因此，我们决定使用相量方法来分离高光谱成像数据，这具有重大的意义。
4色斑马鱼比率高光谱拆分渲染图：tg((cltca:citrine);(ubiq:lynTomato); (lifact:mRuby);(fli1:mKo2))。南加州大学转化成像中心 Rose Chiang 提供。
采用相量分析进行高光谱拆分有哪些挑战？
Cutrale 博士：要对样本温和成像时，信号量有限。人们希望在成像和不同样本类型方面具有灵活性。我们在三年前开始了这项高光谱相量工作，并意识到相量非常有用。它在数据去噪和简化分析方面起到巨大作用。但我们决定更进一步。通常来说，如果要使用相量，您确实要与相量打交道，就必须了解相量分析，这是一大问题。许多人在额外学习新事物方面犹豫不决，因为他们本来就必须要学习很多东西，或者因为他们实在没有时间。那么，如果我们能够利用更加自动化的线性光谱拆分类型，并采用更多样和更灵敏的相量方法呢？这就是我们所做的工作。我们将标准算法的半自动化与相量的灵敏度和多样性相结合，将所有因素整合在一起，合并形成一个混合式方法，一个更灵敏、更快速的光谱拆分算法。使用现在这种方法，用户不愿意的话完全不需要与相量打交道，但仍然可以利用该技术的优势。
这听起来是一个真正的突破，祝贺 Francesco！Scott，您认为在生命科学研究中将相量分析与多高谱数据相结合的实际优势是什么？您会如何对一位将显微镜用作诸多实验室工具之一的癌症研究者解释这项技术的工作原理，在他不用学习任何算法和数学知识的情况下对他有什么帮助？
Fraser 教授：简而言之，这种方法可以让研究者进行高光谱成像和拆分，而不必成为高光谱成像专家。这很像用多摄像头智能手机拍摄一张照片后只要按下按钮就可将其拆分，或者也可以架起一个三脚架，在上面放一部大相机，放入一个照相底片，然后实施这个传统过程所包含的其他一切步骤。后者是在成像设备中采集荧光显微成像数据的常见过程：总是找不到合适的滤光片，即使有合适的滤光片，也会有人在上面留下指纹。显微镜几乎总是必须通过多个滤光片进行多次曝光，然后我们采集这些图像来获得多色图像。我走进显微镜实验室拍照，却发现有人拿走了其中一个滤光片，将其放在另一台显微镜中，然后掉在地板上。但最主要的是，多色成像通常需要收集多张单独拍摄的图像，然后尝试将这些图像剪切和粘贴到一起，就像拼接许多图像。我们方法的强大优势在于，它既不需要将滤光片移来移去，也不需要在改变滤光片位置后进行多次曝光，更不需要用户掌握复杂的算法和数学知识。我们为此使用高光谱成像的智能设备。对我来说，这个差别很大。而且，我不必再担心有人拿走我星期二做实验需要的滤光片，在星期一将其放在另一台显微镜中。
您能否谈谈在获得样本光谱图像之后的算法工具呢？它与目前市场上的线性光谱拆分技术或其他光谱拆分技术相比如何？
Fraser 教授：当然，最明显的是这种方法对样本更温和，但这只是一个方面。最常见的方法是采集图像、存储图像，然后坐在计算机前进行分析。坐下来收集数据与坐下来处理数据之间的时间差可能非常明显。现在有一种可以自动而快速地完成这个过程的方法，用户甚至不会注意到计算过程。就像智能手机从多个摄像头传感器采集图像后合成最终看到的图片一样，基于相量的分析法会为您收集和分析图像。我的许多用户和学生会以为已经完成了工作。但在一周或两周后，他们找时间进行了分析，才发现并未获得自己以为已经获得的结果。这就好比在足球比赛中使用一部老式相机拍照，一段时间后在照片冲印室冲洗胶片，检查所拍照片是否符合预期。但是，那时足球比赛早已结束，您既不能回到那时再拍照，也不能组织另一场比赛补拍错过的场景。通过自动化的相量分析，您可以立即从样本中获得结果——您坐在显微镜前观察样本时就可以提取到信息。
谢谢Francesco和Scott！让我们一起期待这项神奇技术的全球首映礼！
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