HPLC分析中样品溶剂如何选择

样品溶剂的选择是液相色谱分析中不可忽视且很重要的部分，一方面靠经验，另一方面还要考虑到所产生的溶剂效应。溶剂效应是什么？它会对分析结果产生什么影响？如何避免产生的样品溶剂效应？在HPLC分析中样品溶剂的选择和流动相是怎样的联系？本文告诉你!

样品溶剂的选择要求，先粗略的概括一下：

①、能够溶解待测物质；

②、不影响待测物质检测；

③、能够在一定时间范围内保持待测物质稳定。

什么是溶剂效应？

样品溶液的溶剂强度强于流动相溶剂强度时可能会造成的峰展宽、峰分叉现象。即色谱图上较早洗脱的峰前沿或者开叉，与此同时较晚洗脱的峰则为正常的现象。这些现象可能是由以下原因引起的：

出峰时间早；

保留弱；

进样量大。

A.样品溶液的溶剂：100% 乙腈	B.样品溶液的溶剂：18%的乙腈与72%的水（流动相）

上图中，色谱图上较早洗脱的峰扭曲变形或者开叉，与此同时较晚洗脱的峰则较为尖锐与对称，这些现象显示一个比较特殊的起因――样品溶液的溶剂很可能强于流动相。此种强溶剂效应的例子在左图中可见。此处的样 品溶液的溶剂是100%乙腈(100%的强溶剂)，而流动相的组成则较弱（18%的乙腈与72%的水）。第一个峰是开叉的，并且与第二个峰相比，明显变宽 了。当样品溶液的溶剂变成流动相时，所有的峰形都改善了，且变得尖锐。见右图。

为什么呢？这是因为当样品进样时，有可能出现峰展宽，最佳的样品溶液组成和体积将会保持在10%甚至更低，在这个例子里，当样品溶剂与流动相溶剂强度不同时，换句话来说，也就是样品未用流动相溶解，因此，有些样品分子溶解在强溶剂中，并随强溶剂流过柱子，而有些则溶解在流动相中，从而导致峰分叉。

当样品与流动相强度相差较小，进样影响也会小，第一个峰可能会宽于第二个峰，而当这种展宽导致分离度降低时，这样情况应引起注意，在左图中，使用一根短柱，和5μL进样，这与最佳进样体积4μL相近，用了极性更强的溶剂导致分离度明显降低，从2.1（右图）降到1.5(分离度为2或更大是评估一个完善方法的一个必要参数，也是每个方法的验证参数，1.5只是一个基本的分离度，任何一个方法或一根柱子都必需满足这个条件，当进样为一倍时，也就是10μL时，分离度更一步降低，此方法就不行了。）

液相色谱系统的很多问题都能在谱图上反映出来，其中一些问题可以通过改变设备参数得到解决，而其它的问题必须通过修改操作程序来解决。

样品溶剂选择不当的解决方法：

HPLC对溶剂的要求

(1) 高纯度，溶剂与固定相不互溶，并能保持色谱柱的稳定性。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度要求也高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。

(2) 溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性，即足够的溶解能力。溶剂的极性要与待测样品相匹配，如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响纯化分离，且会使柱子恶化。

(3) 溶剂要与检测器匹配

对于紫外-可见检测器，所用流动相在检测波长下应没有吸收或吸收很小。

(4) 化学稳定性好

不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。

(5) 低粘度，沸点适中

减小溶质的传质阻力，降低柱压，利于提高柱效。

常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等；粘度过低的溶剂也不宜采用，如戊烷、乙醚等，易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。

HPLC溶剂关键性能

(1) UV吸收性

HPLC级试剂是用特殊方法生产的含有最少的颗粒和最低的紫外吸收物质，除去具有吸收UV的杂质，在规定的波长上吸光度限制在规定值以内。

(2) 梯度洗脱性能

在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。

采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度。

① 溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能作为梯度洗脱的流动相。

当有机溶剂和缓冲液混合时，可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

② 纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。

③ 防止压力过大。

混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。

例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。

反相液相色谱

(柱效高、分离能力强、保留机理清楚，是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种。适用于非极性-中等极性组分)

固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱

流动相：流动相极性 > 固定相极性

HPLC里面的溶剂效应是如何产生的，该如何避免？

如何判断分叉的峰是否由溶剂效应造成，第一就是通过HPLC仪器比对一下两个劈叉峰的紫外吸收波谱，看看他们是否是完全一样的UV特征吸收，第二将进样体积调节到0.1μL看看，峰行是否好转，如果满足上面两个条件几乎就可以肯定是100%的溶剂效应。产生原因：

1、样品溶液的溶剂很可能强于流动相。例如样品溶液的溶剂是100%乙腈(100%的强溶剂)，而流动相的组成则较弱（18%的乙腈与72%的水）；

2、就是进样量比较大；

3、样品的pH值与HPLC流动相pH悬殊，比如酸性流动相体系，样品pH偏碱性(pH=10),这种情况下也很有可能发生其实上面三个原因归结起来就是一个原因，那就是样品的溶剂与流动相存在一些不同，当样品进入流动相的时候，由于这种巨大的差异，一部分样品溶解进入了流动相，一部分还留在进样的溶剂里面，所以在HPLC上出现了保留的差异，所以要解决这个问题的最佳方案就是，使用流动相的起始梯度溶解样品；如果样品无法完全溶解，只能改用其它溶剂，此时需要降低进样体积，比如 5μL，1μL。