基因治疗利用遗传物质治疗或预防疾病——通常是可能危及生命或致人衰弱且治疗选择有限的罕见遗传性疾病。目的是开发出一种一次性疗法，以纠正疾病的潜在遗传原因。
最早的方法是直接将遗传物质（如功能性基因）导入细胞，以替换、沉默或操纵特定基因，但存在转导效率低，脱靶效应等问题。因此，科学家们也在开发直接基因编辑技术，包括引入分子工具，在细胞中的精确位置移除或纠正现有的 DNA 片段。
基因治疗的成功依赖于使用合适的载体将遗传物质安全有效地递送到受影响的细胞中。该载体或可被直接递送至人体由单个细胞吸收，或可在实验室中递送至患者细胞样本然后返回人体。某些病毒由于具有感染细胞的能力，常被用作基因治疗的载体。一些类型的病毒，如逆转录病毒，将包括新基因在内的遗传物质整合到细胞染色体中。其他病毒，如腺病毒，则将其 DNA 转移到细胞核中，但不与细胞染色体进行整合。此外，病毒还可将基因编辑工具递送至细胞核内。
迄今为止，已有 23 种基因和细胞治疗产品获得美国 FDA 批准，其中包括对神经肌肉疾病、遗传性失明、某些血液癌症等疾病的颠覆性疗法。
2022 年 6 月 22 日，医麦课堂携手安捷伦在线上举办，由安捷伦细胞分析事业部 PLXF 产品专员王捷思、PLXF 产品应用科学家魏玉凤和诊断与基因组学事业部产品经理张佳为我们带来了主题为“基因治疗技术进展”的线上直播课程，助力中国医药产业人才成长。
线粒体功能评估方法
安捷伦产品专员王捷思的分享内容主要包括：
➤线粒体疾病介绍
➤Seahorse 技术在基因治疗研究中的应用
线粒体，是细胞内的能量工厂，是产生 ATP 的主要场所，除了与罕见遗传病相关外，线粒体的功能障碍也与许多常见的疾病相关。在细胞内产生能量的另外一条途径是糖酵解。线粒体呼吸和糖酵解作为细胞内产生能量的两条主要的途径，在细胞的各种过程中发挥着重要的作用。无论是细胞的增殖、分化还是免疫细胞的反应或者是细胞的凋亡都与能量代谢密切相关。
对于线粒体呼吸这条途径，细胞利用不同的底物，比如葡萄糖、脂肪酸、氨基酸，线粒体消耗氧气氧化底物来产生 ATP。所以可以通过测量细胞外溶液中的氧气浓度的变化得到细胞氧消耗速率（简称为 OCR）来测量线粒体呼吸水平。对于糖酵解途径，细胞利用葡萄糖最终转变为乳酸，会分泌氢离子到细胞外溶液中引起细胞外溶液的酸化，可以通过测量细胞外溶液中的氢离子浓度变化得到细胞外的酸化速率（简称为 ECAR）再换算为质子流出速率（简称为 PER）来反映糖酵解水平。
▲XF 测定两种关键能力代谢途径的速率变化
通过线粒体压力测试，可以得到如下的一个曲线图
▲线粒体压力测试
纵坐标是 OCR 也就是细胞的氧消耗速率，横坐标是时间。在测量起始 OCR 值后，可以通过加入寡霉素抑制线粒体 ATP 合酶，此时 OCR 值会降低，这样就得到了 ATP 产生相关联的 OCR 值；之后加入 FCCP，加速线粒体电子传递以刺激细胞达到最大的氧消耗，此时 OCR 值会升高，得到细胞的最大呼吸能力，最大值和基础值之间的差值，称为备用呼吸能力，用来衡量细胞在面对有更多的能量需求，或者是在面对压力的时候的反应能力。
最后加入鱼藤酮和抗霉素 A，来分别抑制复合物 I 和复合物 III，此时 OCR 值会降低，剩下的 OCR 值是非线粒体的氧消耗。通过此实验可以更加全面地来反映细胞的线粒体功能。可以用来评估不同细胞的线粒体功能以验证药物或疗法对细胞线粒体功能的影响。
活细胞成像分析技术
安捷伦产品应用科学家魏玉凤的讲座主要介绍了：
➤基因治疗产品的分类及上市药物概览
➤微孔板检测及成像设备在基因治疗领域的应用
基因治疗主要是分成两大类，第一大类，是基于 DNA 的治疗；第二大类，是基于 RNA 的治疗。基于 DNA 的治疗，又分成两种，第一种是离体基因治疗，一种是在体基因治疗。
对在体基因治疗来说，从 2003 年开始，溶瘤病毒、AAV、质粒分别作为载体都有相关产品上市，针对适应症包括头颈部鳞状细胞瘤、黑色素瘤、肝癌、胰腺癌、重度肢体缺血和因为基因突变导致的视力丧失等，其中以病毒为载体的产品占绝大多数。
Cytation 作为一款高通量的微孔板检测及成像设备，可以帮助评价载体病毒体内体外的转染效率，溶瘤病毒的复制动力学，病毒释放量，病毒滴度等，且其可配合自动化设备，实现无人值守的检测及分析，减少实验人员的工作量及暴露风险。
▲Cytation 可开展的病毒学检测类型
除此之外，Cytation 在前期构建检测模型、基因功能体外评价，抗肿瘤活性，血清水平表达产物检测、免疫原性检测等方面也有成熟的应用;在质控方面，Cytation 可以帮助开展残留蛋白检测、内毒素检测、病毒滴度评价等实验。
▲微孔板检测及成像设备在 AAV 领域的应用
▲微孔板检测及成像设备在溶瘤病毒领域的应用
核酸蛋白质控方案
安捷伦产品经理张佳演讲的部分内容：
➤基因编辑中 gRNA 的质控
➤同源修复时的 Long ssDNA 模板质控
在 CRISPR 工作流程中，向导 RNA(gRNA）的合成是成功进行基因编辑的关键组成部分。由体外转录或合成产生的 gRNA 可以在毛细管电泳上运行检测。小 RNA 试剂盒是此应用的理想选择，它可以从 6-150 个核苷酸的小分子中以高分离度分离。研究人员需要关注杂质或次级结构等重要特征，使样品具有预期的大小和足够的产量，以便用于后续研究。
Long ssDNA 作为 Donor 模板已被发现可以促进同源修复，提高片段敲入效率。片段分析仪系统可用于 dsDNA 酶解产生的 ssDNA 产物的质量控制分析。当 dsDNA 分子量正确并且 ssDNA 分子量较小时，则可得知 dsDNA 已成功酶解。
在高表达单克隆筛选时，可选择用芯片式毛细管电泳的方法比较单克隆株蛋白表达量，筛选高表达细胞株。与常规毛细管电泳相比，芯片式毛细管电泳具备分离时间短、分离效率高、系统体积小且易实现不同操作单元的集成等优势。此时安捷伦的 BioAnalyzer 2100 生物分析仪因为具备金标准、高灵敏度、快速、节省样本等特点可优先考虑使用。
除此之外，2100 分析仪还能针对蛋白做定性或定量分析，因此不仅是在克隆筛选方面，还可以在表达条件优化、纯化条件优化、纯化产物分析、蛋白制剂稳定性分析、蛋白杂质检测等方面有较好的应用。
Q&A 环节节选
Q：seahorse 测 ATP 生成速率与测 ATP 水平有什么区别?
A：Seahorse 能够实时同时测量活细胞中线粒体呼吸和糖酵解 ATP 生成速率，评估细胞代谢表型和代谢转换。
Q：Cytation 开展病毒学检测的优势有哪些?
A:首先，病毒学的检测模式有很多，酶标的检测模式和成像的检测模式可以相互互补；其次，它本身是一个自动化设备，而且可以配置高通量的自动化设备，可实现无人值守的操作以减少实验人员的劳动；最后是软件具有自动化的数据分析功能，可避免付出额外的时间。
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