HPTLC 通用混标 (UHM): 高效薄层色谱系统适用性测试 (SST) 新思路

"在 HPTLC 系统中，每张板都代表一个新的分析体系。每次进行分析操作当天，在每个板上都应执行 SST，以验证其是否符合实验条件要求。SST 通常仅适用于包含预设限值在内的单个方法。如果 SST 失败，则样品检测数据无效，无法进行评估。" 

“

Dr. Tiȇn Do (CAMAG 实验室主管)

在高效薄层色谱 (HPTLC) 中，应用合适的系统适用性测试 (SST) 在每个薄层板上对分析系统进行验证非常重要，是数据有效性的前提，一般是选择几个具有特定分析方法的化学对照物质作为参考。但目前常用的 SST 实验设计具有一定的局限性，列举《美国药典》和《欧洲药典》中关于 SST 的描述内容可见下表：

目前常用 SST 方法及其局限性

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美国药典

欧洲药典

关于

SST 

的描述

使用 SST “检查系统对分离度、位置和条带颜色的适用性”，选择 “在所用色谱条件下，由两种或多种具有相似但可分离的 RF 值的化合物” 作为参考物。 

SST 基于两种具有相似 RF 值的物质的分离，但在规定的色谱条件下几乎不可分离。

现有方法

局限性

美国药典和欧洲药典在定义中都描述了色谱图特定区域内的分离情况。

对于每种方法，都需要开发一个新的系统适用性测试，非常耗时。

如果实验室正在应用许多不同的 HPTLC 方法，则采购这些 SST 所需的化学参考物质可能会增加常规分析的大量成本。

不同 SST 系列的开发和验证也非常耗时。

SST 新思路

HPTLC 通用混标 

针对上文列出的局限性，UHM 应运而生，可用于在常规分析中验证 HPTLC 结果，实现对 HPTLC 色谱图的整个 RF 范围进行验证。

什么是 UHM ？

UHM, the Universal HPTLC Mix，即高效薄层色谱通用混标，由 8 种不同性质的化合物组成，广泛适用于各种 HPTLC 方法的 SST 测试。

HPTLC 通用混标 (UHM) 的开发

01

物质的选择

选择的物质最好具有安全、稳定、无需衍生化即可检测、易于获得且价格低廉等特点。据此，实验人员从数以千计的物质列表中，选择了 24 种化合物。

针对这 24 种化合物在 HPTLC 板上的色谱行为进行研究，分别用 20 种不同展开剂进行洗脱，涵盖尽量广泛的极性和选择性，最终从中选择了 8 种化合物：鸟苷、舒利苯酮、胸苷、扑热息痛、邻苯二甲酰亚胺、氢芴、噻吨酮和 2-苯并三唑四甲基丁基苯酚。 

图为 UHM 在不同展开系统下的色谱行为，在各条件下的选择性均可保证至少 3 - 4 个有效化合物的条带均匀分布在所需评估的范围内

02

评估响应特性

相对湿度对每种物质的选择性有不同的影响。当板的活性偏离预期的相对湿度 0 - 5%、33%、75% 或 100% 时，UHM 的响应特性可以清楚地检测出这些偏离。

对甲苯-乙酸乙酯 90:10 (V/V) 的展开剂组成施加每种组分溶剂 ±10% 的变化，用 UHM 获得的 HPTLC 指纹图谱有显著反应。

针对相同的展开剂进行不同饱和参数设置的考察（不饱和、部分饱和和充分饱和)。结果表明，部分饱和 RF 值相对增加，而完全饱和 RF 值相对降低，UHM 可以检测饱和操作的一般影响。 

03

评估 UHM 性能

分别在实验室内和实验室间进行检测，使用 3 种展开剂并得出 ΔRF，评估 UHM 性能。

在实验室内试验中，ΔRF 为 0.029; 实验室间试验为 0.040。

04

评估不同类型的硅胶薄层板

在色谱系统中薄层板的材料是一个关键参数。由于硅胶的规格不同，例如不同的粘合剂或荧光指示剂的存在，不同的薄层板可能会有不同的选择性。 

使用 UHM 评估了 6 种不同类型的涂敷型硅胶薄层板，使用相同的展开剂，乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水 100:11:11:26 (V/V)。

UHM 在不同类型硅胶薄层板上的选择性评估

UHM 与现行 SST 比较

使用 UHM 和现行的 SST 进行精油标准鉴别。

在原有方法中乙酸异丁香酚 [1a] 和异丁香酚 [1b] 被定义为 SST。作为特定标记物，使用的是芳樟醇和乙酸芳樟酯，或冰片和乙酸冰片酯。在这个例子中，还测试了 3 种精油：薄荷油、薰衣草油和肉豆蔻油。

针对 UHM 和当前 SST 的每个成分，计算平均 RF 值及其预测区间。下图数据表明，UHM 成分的预测区间与原始 SST 的预测区间在同一范围内。

UHM 成分的预测区间与

原始 SST 的预测区间在同一范围内

数据来源: CAMAG 与 Anchrom 印度合作实验室

总结

HPTLC 通用混标 (UHM) 是当前 SST 的一个很好的替代方法。

8 种不同极性、不同化学类别组分的混合物价格低廉、稳定，对验证色谱系统的变化具有良好的响应性。

与当前的 SST 相比，UHM 的成分显示出与已建立的 SST 的物质和特定标记物具有相似的预测区间。

UHM 可以检测展开剂梯度的变化或饱和效应，而许多已建立的 SST 通常只能描述有限的 RF 范围。

会议内容重温

由此可见，高效薄层色谱越来越受实验人员的关注，原因不单在其快速、直观、自由衍生的技术优势，而且适用于复杂成分样品的分离及检测。从以上案例中，通过通用混标的应用，简化 SST 方法开发周期，有效保证 HPTLC 在常规分析检测中的数据重现性、有效性和可靠性。

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