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背景介绍
反相液相色谱(RPLC)是分析研究者常用的分离模式,然而,面对众多的色谱柱供应商和各种填料的色谱柱,使得RPLC色谱柱筛选以及持续的性能评估变得棘手。本文介绍了一种计算计机辅助建立通用RPLC色谱柱性能评估的方法,实验证明,该方法可对多种色谱柱固定相(C18,氰基,苯己基,PFP,极性嵌入等固定相)性能进行有效评估,并通过计算机建模的帮助,极大程度上简化了方法筛选过程,降低人工成本。
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实验内容
01
筛选色谱柱
疏水减法模型常用于固定相的选择,其特征作用力分别是疏水性(H)、空间位阻效应(S*)、氢键酸度(A)、氢键碱度(B)和电离硅醇基与溶质分子在中性或低pH值(C)下的相互作用,从HPLC Columns网站上获取相关参数绘制“雷达图”(图1),可直观地获得色谱柱之间的异同。
图1 色谱柱筛选雷达图(中心点和角点分别对应作用力的最低和最高值)
为了确保所开发的方法探针可以作为测试色谱柱性能和稳定性的通用工具,需要从市场可得的色谱柱中选取具有广泛代表性的色谱柱。
Bucket Ⅰ~V中同一个Bucket中的色谱柱具有相同的选择性,从Bucket Ⅰ~V中分别选择一根代表性色谱柱用于建立通用方法,Bucket VI包含数据库中具有独特选择性的色谱柱,通常用于Bucket Ⅰ~V无法实现有效分离的二级筛选实验,故本次研究不纳入考量。
本次实验最终选择的色谱柱分别为:Poroshell 120 Bonus RP(Agilent),Xbridge C18 (Waters),XSelect HSS Cyano (Waters), Kinetex Phenyl Hexyl (Phenomenex),和XSelect HSS PFP (Waters),由于HSS T3(Waters)对极性化合物的保留性好,也被纳入研究。
02
建立一个识别色谱柱性能或
选择性变化的通用方法
►指针型化合物的选择
本研究以多组分标准混合物(化合物结构见图2)为指针,混合物中各组分具有不同的化学基团,极性范围广,与固定相间可产生多种作用力,因此,混合物中各组分的分离是反映色谱柱固定相性能的有效指标。
图2 标准混合物的7种组分
►实验设计
用6根色谱柱分别在pH2,pH7和pH8组合条件下建立柱温&梯度两因素模型,并将得到的实验数据采用ACD/LC Simulator建模(图3),总共18个2D模型。
柱温&梯度参数组合 | 5-95%B(5min);柱温30℃ | 5-95%B(15min);柱温30℃ |
5-95%B(5min);柱温50℃ | 5-95%B(15min);柱温50℃ |
备注:流动相A为不同pH条件的磷酸盐溶液;流动相B为MeCN。
图3 柱温&梯度剖面图(分离度>1.5显示“橙色”,最佳分离区域标记“★”)
►实验结果
如图3所示,任一流动相pH&色谱柱组合条件下对应的最佳分离区域一致,由ACD软件模拟得到的通用色谱条件如下:
梯度 | Time | 流动相B(%) |
0 | 30 | |
1 | 30 | |
15 | 85 | |
17 | 85 | |
17.1 | 30 | |
20 | 30 | |
柱温 | 50℃ |
►运行模型方法
运行由ACD软件模拟得到的通用色谱条件,获得“6色谱柱×3 流动相pH值”共18张色谱图(见图4)。使用这种方法,18个色谱条件均实现了标准混合物的分离,因此,该梯度可以作为通用探针来评估色谱柱(Bonus RP, C18, T3, Cyano, Phenyl Hexyl, PFP等固定相)的性能。
图4 运行通用探针方法获得的18张色谱图(6色谱柱×3 pH值)
03
通用方法识别色谱柱性能
或选择性变化的实例
选择使用过一段时间的HSS cyano(Waters),运行开发的通用方法,并将色谱图与原始图谱进行对比,可直观的观察到色谱柱性能的衰减(图5),验证了开发的通用方法,可简单、有效的进行色谱柱性能的持续性评估。
图5 色谱柱性能评估对比图
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小结
RPLC作为分析研究者最常用的分离模式,色谱柱固定相种类、生产厂商众多,为分析人员提供更多选择的同时,也带来了更多的挑战。实际工作中,随着色谱柱使用次数增加,尤其是暴露在苛刻的样品基质、广泛的流动相pH值和温度范围时,色谱柱性能会加速下降,因此,需要持续性监控色谱柱的稳定性和选择性,以及时替换性能不佳的色谱柱,保证有效的方法开发、验证、转移和检测工作。
面对繁多的RPLC色谱柱固定相类型,建立一个通用的、可持续的、易操作的色谱柱性能评估方法难度较大,本文借助ACD软件,建立了18种不同条件(6色谱柱× 3 流动相pH值)下的温度&梯度模型,成功开发了一个通用RPLC色谱柱性能评估方法,并使大量的实验能够在最少的人工干预下进行,计算机辅助建模已然成为加速分析方法开发的有力工具。