2022年9月5日，Nature Methods杂志在线发表研究论文“De novo construction of T cell compartment in humanized mice
engrafted with iPSC-derived thymus organoids”，Zeleniak等人使用组织工程方法，建立诱导多能干细胞（iPSC）来源的人工人胸腺类器官（iPSC-胸腺），并证明其在移植免疫系统人源化小鼠后支持从头生成多种有功能的人 T 细胞群[1]。这一成果将大大增加人源化小鼠模型在人T细胞免疫研究中的可及性，加速动物研究成果向临床转化。进一步改进类器官构建方案后，还有望从患者自身iPSC建立人工胸腺用于免疫缺陷疾病治疗。
类器官作为微型体外器官模型，可以自我组织并分化功能细胞，在结构和功能上模拟人体内器官。2013年被Science杂志评为年度十大技术，2017年被Nature Methods评为年度方法。分析类器官的形成可以加深对人体发育和组织/器官再生机制的理解，同时类器官也是疾病建模和药物筛选的有力工具。免疫系统人源化 (Hu) 小鼠模型是模拟人体免疫系统作用的强大工具，被广泛用于临床前研究和药物发现。依据构建方法，可以分为三大类型，移植成熟PBMC的Hu-PBMC/Hu-PBL小鼠，移植造血干细胞（HSC）的Hu-HSC/Hu-SRC小鼠，同时植入人胎胸腺和胎肝组织以及造血干细胞的Hu-BLT小鼠。其中Hu-BLT小鼠具有最完善的人免疫系统，人胸腺细胞能够调节T细胞发育和成熟，对于适应性免疫研究具有重要意义，然而显而易见的组织稀缺和伦理问题限制了它们的广泛使用[2]。Zeleniak等人的研究中，使用iPSC
3D培养诱导而来的iPSC-TEPC（胸腺上皮祖细胞）和从脐带血分选的CD34+ HPC（造血祖细胞），在去除所有细胞的小鼠胸腺支架上人工重建了人HPC/iPSC-TEC胸腺类器官，克服了人胸腺组织来源问题，并在这一类器官模型中体外验证了支持T细胞发育的能力。
作者进一步将iPSC-胸腺类器官和CD34+ HPC同时植入Hu-SRC小鼠建立Hu-Thor小鼠模型，对T细胞功能的评估分析表明，这些小鼠表达了多样化的人T细胞受体库，TCR介导的促炎反应、同种异体肿瘤移植物生长的抑制和免疫球蛋白类别转换都得到恢复，证明其形成了有功能的人T细胞区室。
这项研究在构建人工iPSC-胸腺类器官和Hu-SRC、Hu-Thor小鼠模型时，都使用了美天旎CD34 MicroBead Kit UltraPure, human磁珠分选的CD34+细胞。在三类经典的免疫系统人源化小鼠模型中，Hu-HSC/Hu-SRC和Hu-BLT的构建都需要对免疫缺陷小鼠植入CD34+ HSC，高活力且高纯度的HSC对于成功重建人源免疫系统同时避免移植物抗宿主病（GvHD）至关重要。美天旎的CliniMACS系统和CD34磁珠在2014年即获得美国FDA批准用于急性髓系白血病的造血干细胞移植治疗。对于研究级造血干/祖细胞分选，提供CD34 MicroBead Kit和CD34 MicroBead Kit, Ultrapure纳米级磁珠，后者尤其适合于碎片含量高、目的细胞丰度低的样本，能够显著减少分选后的碎片和死细胞含量。
CD34 MicroBead Kit和CD34 MicroBead Kit, UltraPure的分选效果比较Hu-HSC/SRC模型能建立人的固有免疫系统和淋巴细胞，通常不发生或发生轻微的GvHD，可用于长期研究，是目前使用最广泛的一类免疫系统人源化小鼠。以下通过一个实例介绍自动化富集CD34+ HSC构建Hu-HSC/SRC模型的方案。
Hu-HSC/SRC小鼠模型构建流程，本例中受体使用BRGS免疫缺陷小鼠[3]1. 脐带血通过密度梯度离心分离单个核细胞（MNC）。
2. CD34 MicroBead Kit和autoMACS Pro全自动细胞分选仪阳性分选造血干细胞，使用双阳性分选程序PosselD2实现最高纯度分选。
3. 流式细胞分析富集细胞的CD3和CD34表达，CD34+细胞活率大于99%，纯度大于90%。基于这一分选方案，从~8×108脐带血MNC分离得到2.7×106±0.22×106CD34+细胞，平均每份脐带血样本能够建立50只人源化小鼠。
从脐带血富集人HSC以建立人源化小鼠[3]
4. 分离的CD34+细胞短期扩增培养3-6天，培养基添加10 ng/mL IL-6、20 ng/mL SCF和10 ng/mL Flt3配体，细胞冻存。
5. 新生BALB/c-Rag2nullIl2rγnullSIRPαNOD（BRGS）免疫缺陷小鼠亚致死剂量辐照处理，破坏自体骨髓造血功能。
6. 辐照后24 h内将扩增的人CD34+细胞经尾静脉或骨髓腔注射入受体小鼠，每只小鼠注射2–6×105细胞。
7. 移植10-16周后，流式细胞分析外周血中的人和小鼠免疫细胞群，评估小鼠中的人HSC重建。
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免疫系统人源化小鼠构建与应用application note
参考资料
[1] Zeleniak A, Wiegand C, Liu W, McCormick C, Ravikumar
K, et al (2022) De novo construction of T cell compartment in humanized mice
engrafted with iPSC-derived thymus organoids. Nature Methods doi: 10.1038/s41592-022-01583-3.
Epub ahead of print.[2] De La Rochere P, Guil-Luna S, Decaudin D, Azar G,
Sidhu SS, et al (2018) Humanized mice for the study of immune-oncology. Trends
in Immunology 39(9): 748-763.[3] Julie Lang (2022) Generation and preclinical
applications of humanized mouse models to study human immunity and cancer
immunotherapy. Miltenyi application note.
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