背景：
杜氏肌肉营养不良症( Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)，乃遗传性肌肉萎缩病。它的基因( Dystrophin gene)存在于X性染色体中( Xp21 )，因此它是透过性连锁式隐性遗传型态传播的。男性只有一个X性染色体，因此病患者大多为男性；若女性的一对X性染色体中其一携有异变的 Dystrophin 基因，她便成为一个 DMD 的携带者，她的儿子有二分一的机会成为病患者，她的女儿则有二分一机会成为 DMD基因携带者。
Dystrophin基因乃现时所知人类基因中体积较大的一种，它的制成品 Dystrophin ，与其他相关的蛋白质，是稳定肌肉细胞膜的一个重要部份。它最重要的功能是维持肌肉细胞的稳定性，使它在肌肉收缩的过程中，不会受到破坏，杜氏病患者因肌肉中缺少了Dystrophin，令到肌肉自出生后，便不断受到破坏和萎缩。Dystrophin 基因亦会受到另一种较轻微的突变所影响，导致病情较轻的碧加氏肌肉营养不良症( Becker''s Muscular Dystrophy，BMD )。
杜氏肌肉营养不良症会导致肌纤维无力、萎缩。主要是进行性的肌肉无力和萎缩。多数是在4岁以前发病，比如开始发现男孩走路摇摇摆摆，之后就发现他上台阶特别费劲，他起身也很困难，如果要是想起来，需要蹭着身起来。主要是肌肉无力，少部分还会连累心脏，部分病人还会导致智力低下。
摘要：
基于寡核苷酸基因治疗是战胜杜氏肌肉营养不良症最佳途径之一。由反义寡核苷酸 (ASO) 诱导的患者 DMD 前体 mRNA 的外显子跳跃被期望用于产生较短，但有部分功能的肌营养不良蛋白，例如较轻的 Becker 肌营养不良症患者所具有的蛋白。我们正致力于开发修饰的核苷酸，例如 2’-O,4’-C-乙烯桥连核酸 (ENAs)，它们具有高核酸酶抗性和对互补 RNA 链的高亲和力。在这个研究中，我们展示了 Renadirsen 的临床前特征（体内外显子跳跃活性、血液稳定性、药代动力学和组织分布），这是一种用 2’-O-甲基 RNA/ENA 嵌合硫代磷酸酯修饰的新型 ASO，设计用于肌营养不良蛋白外显子 45 跳跃和目前正在进行临床试验。
关键词：Renadirsen；ASO；Clarity OTX；ENA；
样品信息 ✦
Renadirsen
实验部分（仪器、试剂与材料）
主要仪器设备
RT-PCR，LC-MS/MS
试剂材料
乙腈、三乙胺、乙酸质谱纯
样品制备
将等份 Clarity OTX 加载缓冲液与血浆样品混合，然后加载到固相萃取柱上。固相萃取分离柱（Clarity OTX 100 mg/3 ml Phenomenex），首先用甲醇润湿，然后在上样前用 Clarity 平衡缓冲液（10 mmol/l 磷酸盐，pH 5.5）进行平衡。对于组织样品，它们首先在 0.1 mol/l Tris 缓冲液（pH 8.0）中均质化，然后与等量的裂解加载缓冲液混合。上样后，将平衡缓冲液加入小柱中冲洗两次，然后用 Clarity OTX 洗涤缓冲液（10 mmol/l 磷酸盐，pH 5.5/50% 乙腈）冲洗。然后加入洗脱缓冲液（100 mmol/l 碳酸氢铵，pH 8.0/40% 乙腈/10% 四氢呋喃）以从柱中洗脱样品。然后将样品快速真空蒸发至100 μl，用于液质分析。
图1 Renadirsen 的位置、核苷酸序列和结构示意图。(a) Renadirsen 的位置示意图。方框和条形分别表示外显子 45 和侧翼内含子。粗条代表 Renadirsen。(b) Renadirsen 的核苷酸序列（上）和结构（下）。大写字母和带下划线的大写字母分别表示 2’-OMe RNA 和 ENA。ENA-C和 ENA-T 分别代表 2’-O,4’-C-ethylene-5-methylcytidine 和 2’-O，4’-C-ethylene-5-methyluridine。Renadirsen 的 3’末端附有一个 2-羟乙基磷酸基团。Renadirsen的所有核苷酸间键都是硫代磷酸酯键。
实验结果
图2 Renadirsen在小鼠血液中的稳定性和药代动力学。(a) 使用 LC-MS/MS系统分析小鼠血液中Renadirsen的稳定性，并测定峰面积比 (Renadirsen /IS)。各时间点的数据以稳定性%表示，0 min时的峰面积比为100%。(b) 以 1、3和10 mg/kg的剂量单次皮下注射mdx小鼠雷那地森钠的药代动力学，使用 LC-MS/MS 分析。在给药后5、15和30分钟以及1、2、4、8和24小时收集血样。(a) 和 (b) 中的数据以 ±SD表示；n = 3。
图3 使用 Agilent 2100 生物分析仪计算来自胫骨前肌、膈肌和心肌的肌营养不良蛋白mRNA的外显子45跳过RT-PCR产物的浓度。(B)中的数据显示为平均值±SEM；n = 3–4。
结论：
与Renadirsen具有相同序列但通常由PMO和2’-O-Me PS修饰的ASO相比，Renadirsen的全身给药促进了心肌、骨骼肌和膈肌中肌营养不良蛋白外显子的跳跃。这些发现表明，Renadirsen有望作为一种治疗剂，不仅可以改善骨骼肌症状，还可以改善DMD患者的其他症状，例如心功能不全。
本文引用于Curr. Issues Mol. Biol. 2021, 43, 1267–1281
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