必追的国自然热点② | 空间蛋白质组学，打开“组织微环境”的黑匣子

国自然一直以来都是学术界的风向标，以国自然热点为课题方向，能有效提高国自然申请的中标率。为此我们策划了“必追的国自然热点”系列文章，精选了2022年国自然中标项目中的7个热门课题 (乳酸化修饰、免疫调控、血管功能、干细胞、细胞自噬、代谢重编程、线粒体) 进行详细解读，希望能为大家带来启发。

往期速览

第一弹：代谢“白天鹅”——乳酸化修饰 (点击阅读)

第二弹：空间蛋白质组学，打开“组织微环境”的黑匣子

近几年，空间组学(Spatial omics) 的热度与日俱增[1]。2020年该技术被Nature Methods 评为年度技术方法之后，又上榜《Nature》2022值得年度关注的七大榜单技术，被誉为“生命科学”的下一个风口[2]。今天小编想要跟大家介绍的是其中独树一帜的空间蛋白质组技术。

蛋白质是生命活动的直接执行者，获得组织空间层面的蛋白定位表达谱对于解析组织微环境、诊断及预后、以及精准医疗具有重要的价值。2022年，科技部发布国家重点研发计划“生物大分子与微生物组”重点专项，明确了组织微环境中蛋白质组空间分布异质性的重要性和必要性。

先前我们介绍了空间蛋白组的技术原理与特征 (必追的国自然热点，空间蛋白质组学技术详解)，接下来，我们以各领域中的代表性文章，为大家介绍一下空间蛋白组在不同研究方向的研究思路及特点，帮助大家选择~

肿瘤预后靶点研究

1. Nature 空间蛋白质组学揭示卵巢癌转移的关键调控靶点

肿瘤异质性研究

2. Nat Biotechnol 空间蛋白质组学揭示肿瘤异质性

疾病标志物研究

3. Cell Rep Med 空间蛋白质组学分析鉴定子宫内膜癌的疾病早期诊断标志物

疾病机制研究

4. Nat Neurosci 空间蛋白质组学揭示多发性硬化症早期发病机制

组织蛋白组图谱研究

5. Nat Commun 空间蛋白质组学绘制细胞外基质调控表皮生长图谱

1. Nature：空间蛋白质组学揭示卵巢癌转移的关键调控靶点

高级别浆液性卵巢癌 (HGSC) 中，早期的腹腔转移是导致不良预后的首要原因。2019年发表在Nature正刊的文章中，芝加哥大学的Ernst Lengyel与德国马普所Matthias Mann组等合作，针对卵巢癌以及卵巢癌附近基质开展空间蛋白质组学分析，成功揭示了NNMT作为基质细胞对肿瘤转移的关键调控靶点，也为未来有针对的卵巢癌转移靶向治疗提供了新的思路。

研究者首先利用显微切割技术对来自11名HGSC患者的组织样本进行显微切割后获得的107个微量样品进行空间蛋白质组学分析。研究共鉴定到6944个蛋白，其中平均每个样本鉴定蛋白数量为4942个。在原发瘤与转移瘤基质中的差异蛋白中，发现其中一种甲基转移酶NNMT蛋白。NNMT的IHC分析发现在网膜转移的基质中表达增加，在正常输卵管，卵巢或网膜的基质中不表达。最后，功能与机制分析揭示，NNMT是维持成纤维细胞表型的重要的调控分子，是基质细胞对肿瘤转移的关键调控靶点。

图1 卵巢癌空间蛋白质组学研究策略以及数据概览

2. Nature Biotechnology：空间蛋白质组学揭示肿瘤异质性

空间蛋白质组学可以获得组织不同于区域内的蛋白特征表达谱，广泛应用于肿瘤细胞异质性研究。2022年5月19日，国际权威期刊Nature Biotechnology (IF=54.91)上发表了Matthias Mann团队题为“Deep Visual Proteomics defines single-cell identity and heterogeneity”的文章。文章报道了一种称之为深度可视蛋白质组学(Deep Visual Proteomics，DVP) 的空间蛋白质组学方法，并应用在临床肿瘤研究当中，从亚细胞维度和空间维度揭示了肿瘤异质性，为对疾病的认识，及诊治新策略的开发，提供了前所未有的洞察。

该研究使用人工智能结合的激光显微切割捕获技术，从样本中精细收集“目标细胞群”进行蛋白组学分析，能区别具有特异性表型的细胞，并借助蛋白组学分析该细胞的潜在功能。在黑色素瘤组织中，该方法精确分析出，仅在肿瘤区域中出现的与免疫调控和DNA复制相关的特征性蛋白。以上研究结果表明，DVP在空间上解析肿瘤异质性，提供了绝佳的蛋白分子分析能力，是临床研究中更详细地了解健康和疾病机制的强大武器。

图2 DVP应用于原发性黑色素瘤组织

3. Cell Reports Medicine：空间蛋白质组学分析鉴定子宫内膜癌的疾病早期诊断标志物

子宫内膜癌 (EC) 是最常见的妇科癌症之一。前哨淋巴结 (SLN) 是指原发肿瘤发生淋巴结转移所必经的第一批淋巴结，可以反映整个区域淋巴结累及的状态。SLN活检已成为皮肤黑色素瘤和乳腺癌成熟的标准检测方法，SLN状态同样可能是评估EC的一个主要预后因素，但尚有许多不明确或有争议的问题，需要更多前瞻性研究。

2022年6月15日，Cell 旗下子刊Cell Reports Medicine (IF=16.988) 杂志发表了题为“In-depth proteomics analysis of sentinel lymph nodes from individuals with endometrial cancer”的文章。研究人员对来自EC个体的SLN进行了精确的空间蛋白质组学研究，确定SLN蛋白质组变化与肿瘤等级相关联，进一步证实了SLN与EC发展的相关性。该研究确定并验证了将EC和SLN癌症分级联系起来的五种关键蛋白质，可在以后用作EC的诊断靶标。

研究者采集了健康及I-III级子宫内膜癌患者的前哨淋巴结和子宫内膜组织进行分析高精度空间蛋白质组学分析。基于IHC的实验结果，研究者对病理学家选择的感兴趣区域(ROI)进行了基于质谱的空间蛋白质组学分析（图3B）。

图3 空间蛋白质组学的工作流程

此外，研究还确定了蛋白质表达的差异和EC中特定蛋白表达差异及肿瘤等级之间具有相关性。通过对SLN和EC蛋白质组学数据进行ANOVA分析，确定了健康组织及不同等级癌症病人SLN和EC组织之间的过度表达蛋白，其中包含22种参与免疫反应的蛋白质，此外，对不同癌症等级的SLN和EC蛋白表达谱之间进行相关性分析，筛选得到5种癌症等级依赖性表达于EC和SLN组织的biomarkers。这些生物标志物经免疫荧光实验验证后，结果发现筛选得到的5种biomarkers在SLN和EC中有一定联系，并且在一定程度上反映了EC癌症的进展，可在以后用于开发高灵敏的微创EC诊断方法。

4. Nature Neuroscience：空间蛋白组揭示多发性硬化症早期发病机制

多发性硬化症 (MS) 是一种常见的中枢神经系统致残性自身免疫性疾病，其主要临床特征为反复发作的脑、脊髓及视神经受损。抑制疾病进展的药物开发是一项迫切的临床需求，但目前对MS复杂发病机制缺乏透彻的了解。

2022年6月20日，国际神经领域权威期刊Nature Neuroscience (IF=28.771) 上发表了题为“Identification of early neurodegenerative pathways in progressive multiple sclerosis” 的最新成果。研究人员对MS患者的脑组织进行了空间蛋白组及空间转录组研究，并将得到的数据与他们已发表的单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 和体内扰动模型数据相结合，在空间分辨神经退行性变的背景下，系统性地解剖了进展性MS的潜在疾病成分，确定与这些成分相关的配体-受体相互作用情况，并优先将中枢神经系统富含的受体作为新的药物靶点，从而弄清进展性MS的复杂发病机制。

研究人员首先对死亡的13例进展性MS患者和5名对照组的37个新鲜冷冻皮质脑组织切片 (32个MS患者和5个对照组) 进行了空间转录组学研究，结果表明MS患者在疾病进展过程中向MS相关的神经退行性变状态的转变。随后，针对14名进展性MS患者 (56个样本) 和7名对照组 (9个样本) 的65个灰质样本的空间蛋白质组分析，质谱鉴定出4541种蛋白质，并发现MS神经退行性变相关生物过程。

研究通过评估了灰质斑点转录组中1396个治疗配体-受体对的表达水平，获得了从空间尺度解析的428个配体-受体相互作用的表达数据。通过比较MS患者和对照组的配体-受体的相互作用情况，发现患者早期神经元衰退区域内的营养和抗炎细胞间通讯丢失，并发现了潜在的MS治疗新靶点。

图4 高灵敏度蛋白质组学在蛋白质水平验证与MS神经退行性变相关的生物学过程

5. Nature Communications：空间蛋白质组学绘制细胞外基质调控表皮生长图谱

2022年7月12日，中国医学科学院北京协和医院冷泠/李军团队与国家蛋白质科学中心 (北京) 马洁/朱云平团队合作在权威期刊Nature Communications (IF=17.694)杂志上发表了题为“Spatially resolved proteomic map shows that extracellular matrix regulates epidermal growth”的最新成果。研究利用基于质谱的空间蛋白质组学技术构建了分层皮肤蛋白质图谱，提供了对ECM蛋白促进EpSC生长和功能的见解。该研究有利于未来皮肤溃疡或涉及表皮细胞功能障碍和再上皮化阻滞的难治性病变疾病的临床治疗。

研究者首先通过LCM显微切割，对健康人体皮肤组织的6个分层精准取样，解析了这六个皮肤层的分子组成和皮肤结构特异性功能，并将这些数据与精确的解剖定位相结合，构建了人体皮肤的空间蛋白质组图谱。

研究针对二期梅毒为研究对象，运用空间蛋白组技术对二期梅毒患者皮肤组织进行精细分析。结果显示，二期梅毒皮肤干细胞的细胞周期和形态、汗腺和毛囊及关键的Wnt发育通路等都受到严重影响，并发生中性粒细胞和白细胞的聚集，以及固有免疫反应上调和趋化因子的产生，且皮肤基底膜的多种蛋白组分缺失。

综上所述，该研究采用空间蛋白质组学技术构建了分层皮肤蛋白质组图谱，发现基质蛋白作为干细胞微环境在调控皮肤表皮干细胞生长中起着重要作用，并在微生物导致皮损或难愈性皮肤疾病的临床治疗中具有巨大的潜力。

图5 正常人皮肤组织的空间蛋白质组分析

参考文献

1. Mark A. Eckert, et al. 2020. spatially resolved transcriptomics. Nat Methods 18, 1 (2021).

2. Michael Eisenstein,et al.  2022, Seven technologies to watch in 2022. Nature.

3. Eckert MA, et al., 2019, Proteomics reveals NNMT as a master metabolic regulator of cancer-associated fibroblasts. Nature.

4. Andreas Mund, et al. 2022. Deep Visual Proteomics defines single-cell identity and heterogeneity. Nature Biotechnology.

5. Aboulouard., et al., 2021, In-depth proteomics analysis of sentinel lymph nodes from individuals with endometrial cancer . Cell Reports Medicine.

6. DeLuca GC, et al. 2022, Identification of early neurodegenerative pathways in progressive multiple sclerosis. Nature Neuroscience.

7. Jun Li, et al. 2022. Spatially resolved proteomic map shows that extracellular matrix regulates epidermal growth. Nature Communications.

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