数字 PCR 原理及其优势
Mediator Probe PCR 实验原理
图 1 媒介探针(Mediator Probe)
通用探针 5’ 端为茎环状发卡二级结构,5’ 末端链接有淬灭基团,相反的另一端连接有荧光基团,荧光基团和淬灭基团二者空间上紧密靠近,并通过连接二者的亚胺进行充分的荧光共振能量转移(FRET),从而将荧光基团激发后的荧光进行淬灭。
Mediator Probe PCR 实验独特优势在于可拓展为多重荧光标记靶点,且靶点配色方案不固定,因此可根据不同的应用轻松进行调整。使用此方法,作者分别设计了 4 组 MP 和 4 种荧光基团标记的 UR 探针,用于 ddPCR 过程中对 3 种不同的基因突变位点和 WT 基因位点进行筛查测定。
ddPCR 实验设计及条件优化
LabDisk 的 12 位 ddPCR 平台具有通量高的特点,搭配 Lionheart 全自动显微成像系统和 Gen5 高内涵分析软件,通过自动图像捕获和自定义分析管线设定,非常适合进行引物和探针浓度摸索,和不同实验靶点检测灵敏度验证等实验。
图 3 Lionheart LX 和 Gen5 软件搭配用于 LabDisk 全自动 4-plex ddPCR 微滴的全自动荧光拍摄和分析工作流程
实验中,将 mutant DNA 稀释为 4 个浓度:3540 、354 、35 和 3.5 个 copies(cps)每个反应,用于每个 mutant 靶点,而 wild type DNA 浓度被固定在大约 15000 cps /反应。PCR 反应接受后,将 12 个 ddPCR 单元进行裁剪并粘贴在玻片上,使用 2.5x 物镜进行 56 个视野 Montage 扫描,Gen5 软件进行拼接,具体扫描参数如下:GFP 、RFP 、Texas Red 和 CY5 通道分别用于拍摄 FAM 标记的 WT 靶点、HEX 标记的 KRAS G12V 点突变、AttoRho 101 标记的 KRAS G12A 点突变和 Cy5 荧光基团标记的 KRAS G12D 序列。
Gen5 软件通常可以用于细胞和细胞器计数分析,在这里,经过略微的调整,用于微滴计数并进行阳性和阴性微滴辨别。具体参数有背景荧光测定、微滴直径范围(45um ~ 90um)、微滴形状(圆度 >0.6)和荧光强度阈值。在进行亚群分析区分阳性和阴性微滴时,圆度和平均荧光强度这 2 个参数必不可少,非常重要的一点是,圆度作为分析参数,可有效排除灰尘颗粒或其他杂质。由于 GFP 通道具有最高的微滴背景信号,因此可用于检测计算微滴总数量,其余每个通道都作为一个亚群分析不同的突变位点。
图 4 Gen5 全自动微滴分析管线示例图
实验数据分析及结果发表
图 5 离心微流控 ddPCR 图像及明场拍摄的微滴
正如上文所述,12 个单元不但允许在一次诊断应用中进行大量的反应,而且能够高效地优化微滴稳定性参数。在 2% 表面活性剂浓度下,可产生均一的微滴,但在PCR循环阶段,oil 会完全蒸发,导致大量的微滴融合。图 6A 展示了由于没有表面活性剂导致的微滴融合,融合微滴显示出更亮的亮度。
图 6 评估乳化 oil 和 PCR-oil 中的表面活性剂浓度
荧光图片相对于明场,具有更高的对比度,在微滴测定阶段,使用 Gen5 软件全自动测量 6000 个微滴,测得其平均直径为 82.7±9 um ,由此可计算得知 10ul PCR mix 大约可产生 35000 个微滴。通过计算和曲线拟合,可发现每个突变靶点都具有非常高的线性(R2=0.99),并且均达到了 35 cps /反应 的检测限(LoQ),甚至可检测到更低浓度的 KRAS G12V 和 KRAS G12A 突变到 3.5 cps /反应。
图 7 微滴多色荧光叠加拍摄和核酸浓度分析
表 2 不同靶点 DNA 浓度计算统计
通过使用 4 重 ddPCR 结合 Lionheart 全自动显微成像平台,优异的实验数据也向我们证明了这一技术的高灵敏度,同时也展示了在癌症筛查中的应用潜力。感兴趣的小伙伴快来利用你身边 Agilent BioTek 的 Lionheart 系列和 Cytation 系列全自动成像系统试一试吧!
参考文献
1、Mediator probe PCR: a novel approach for detection of real-time PCR based on label-free primary probes and standardized secondary universal fluorogenic reporters. Clin Chem. 2012 Nov;58(11):1546-56.
2、Fluorescence signal-to-noise optimisation for real-time PCR using universal reporter oligonucleotides. Anal. Methods 2018, 10, 3444–3454.
3、Centrifugal Microfluidic Integration of 4-Plex ddPCR Demonstrated by the Quantification of Cancer-Associated Point Mutations. Processes 2021, 9, 97.
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