沃特世CGT加速器第三期：基于QDa平台的 LNP制剂研发和原料监测

沃特世

2022.11.17

作者沃特世

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脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle,LNP)作为mRNA疗法或疫苗的优选递送载体，被称为递送疫苗有效物质进入预定轨道的“运载火箭”，是目前非常具有潜力的递送载体之一。LNP通常由四种脂质组成，且每一种都具有特定功能，需要特定比例才能有效、安全地递送API。LNP四种组成成份中的胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和PEG化脂质约占50%。这些组分一般具有结构和稳定性作用，通常作为原材料从第三方供应商处取得。LNP的另一半由阳离子脂质或可电离脂质组成，电离脂质通常是专有的，并在内部生产以保护知识产权。在任何一种情况下，无论是外包还是自主生产，都需要可靠的分析技术来确保药品的安全和有效。

基于LC的方法经常被用作分析LNP的主要平台；基于MS的方法往往部署在上游用于表征和鉴定；而使用蒸发光散射检测器(ELSD)等基于光学方法的检测器往往部署在研发后期或生产QC中。然而，图1显示的数据可以明显看出，组成脂质纳米颗粒中的不同成分在不同类型检测器中的响应并不相同。

图1. 3种类型检测器分析脂质体组成成分的响应。峰1-5是SM102、DOTMA、胆固醇、DMG-PEG2000和DSPC。SM102、胆固醇、DMG-PEG200和DSPC以 50:38.5:1.5:10的摩尔比制备，代表LNP样品；DOTMA以相对于SM102的一半浓度加入。

虽然ELSD非常适合检测非挥发性/半挥发性分析物，且低至纳克级别的检测能力可以满足大多数分析需求，但ACQUITY QDa质谱检测器将检测限提高了多个数量级。此外，用户还可以通过互补的质谱数据，为杂质分析提供了更低的检测限度和更高的诊断能力。

原材料筛选

— 助力筛选盲点峰

在评估LNP生产和制造过程中使用的原材料时，往往会评估大量分析数据并作出关键决策。如图2所示，对来自三个不同供应商的脂质成分进行分析。ELSD中不会被检测到的杂质峰，在使用ACQUITY QDa质谱检测器时可以在主峰前检测到不同水平的半挥发性杂质。除了检测低丰度物质外，启用ACQUITY QDa工作流程还提供了用于评估包含多种杂质存在峰的质量数信息。如图2A底部插图所示，发现了三种杂质总峰面积为6.4%。这种情况下，由于能够利用质谱数据中的提取离子色谱图(XIC)在5.4分钟时显示部分共洗脱，可以辨别存在的杂质数量。

图2. 脂质原料筛选。使用ELSD和MS检测分析来自3个不同的供应商脂质纳米颗粒成分DSPC。使用从MS数据中的提取离子色谱图评估半挥发性杂质，其中供应商1-3分别观察到的总杂质含量为A)6%、B)3%和C)0%。

工艺开发

— 快速建立杂质档案

谱图水平整合分析样品信息可以帮助更高效地理解和调整工艺开发和生产过程。含有胺和/或不饱和脂肪酸的脂类受到氧化以及去饱和/饱和反应的影响可能产生工艺/产品相关杂质。在这些情况下，基于光学的色谱图可能没那么容易解释杂质的生成路径，因为每个事件可以根据存在的杂质生成一个唯一的峰或一组峰(图3A)。利用从质谱数据中提取的离子色谱图，我们可以初步判断与杂质谱相关的可能路径(图3B)，以指导后续使用高分辨率质谱平台进行杂质鉴别。考虑到许多可电离脂质是在内部设计和制造的，图3的例子展示了如何利用色谱和质谱的互补信息来提高批与批之间的工艺稳定性比较效率。

图3. 工艺开发。显示了使用A)ELSD和B)MS检测对可电离脂质Dlin-MC3-DMA的分析。提取离子色谱图使用基于主组分饱和、去饱和和氧化产物计算的质量数以确定目标峰。

制剂和稳定性研究

— 互补的质量数据为配方开发提供更多思路

除了氧化和饱和/去饱和之外，脂质纳米颗粒的成分可能会发生水解事件，这会影响脂质纳米颗粒疗法的稳定性和安全性。为了证明这一点，对磷脂DSPC进行了强制降解研究。如图4的ELSD色谱图所示，当暴露于0.01 N NaOH溶液时，DSPC主峰降解为多个峰。仅从这些数据就可以得出结论，DSPC对pH值敏感。然而，在查看使用ACQUITY QDa质谱检测器获得的质谱图时，我们可以初步判定 0.3分钟和4.2分钟处的峰分别为极性头基(258.0 m/z)和甲基化脂肪酸甲基硬脂酸酯(299.2 m/z)。该信息初步证实了DSPC的酯键易于水解，这可以为确定配方产品的稳定基质提供更多指导。

图4. 配方和稳定性研究。使用0.01 N的NaOH溶液对脂质纳米颗粒组分DSPC进行强制降解研究。

集成式的数据管理方式

— 方便上游下游的快速部署

质谱数据作为补充手段，可以帮助我们更好地了解LNP组分及其相关杂质。基于Empower色谱数据系统(CDS)集成了ELSD光谱和ACQUITY QDa质谱数据分析，可以实现更便捷的数据访问和结果管理。如图5所示，来自色谱柱的洗脱液在ELSD和ACQUITY QDa 质谱检测器之间分流。在这种情况下获得的数据，色谱和质谱信息会自动匹配。用户可以通过正交分析来进行脂质化合物确认和杂质识别。同时，通过建立脂质成分库也可以加快LNP成分和杂质的识别。

图5. A)Empower处理方法的谱库搜索功能示例以及如何定义参数以执行MS数据的光谱搜索；B)ELSD和相应的谱图结果，用于分析存在于DSPC中的原料杂质。“最佳”谱图匹配显示在结果表的右侧两列中。红色结果表示根据Empower处理方法的杂质选项卡中设置的标准，%面积的杂质超过了ICH杂质阈值（报告：0.05，鉴定：0.10，鉴定：0.15）。

除了杂质鉴定工作流程之外，Empower还为用户提供了为不同字段类型定义检测阈值的能力。LNP混合物的所有成分都根据RT和谱图进行识别，还可以为不同类型的主成分设置质量范围阈值，以提高确认的准确性和特异性。如图6B的处理结果所示，LNP混合物的所有成分都根据RT和谱图正确识别。然而，胆固醇是红色的，表明相关的质量信息与“阈值”参数中定义的接受标准不匹配(369.3 m/z与387.6±1 m/z)。这种情况下，差异(Δ18.3 m/z)与电离过程中可能发生的水损失相差0.3Da。此外，用户可以利用Empower中的综合报告功能，基于色谱和质谱数据来定制结果报告。

图6. A)在Empower处理方法中设置阈值以及指定字段定义错误上限和下限的示例；B)ELSD数据和对应的质谱数据，用于分析组成脂质纳米颗粒的一组脂质组成。红色结果表示超出处理方法“阈值”窗口中定义的质量差(±1 m/z)的组分。

图7. 报告，显示了使用ELSD和QDa双检测器分析脂质纳米颗粒的Empower报告示例。超过处理方法中定义的阈值或限制的表格结果将自动以红色注释。

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基于基因的疗法代表了药物开发的一个新篇章，在治疗和预防疾病方面具有巨大前景。脂质纳米颗粒作为“递送载体”是最终治疗产品的一部分，反映了与这些新分子研究相关的复杂性和分析挑战。本研究展示了如何在双检测器配置中利用ACQUITY QDa质谱检测器获取的互补质谱数据来提高LNP工作流程的分析灵敏度和鉴定能力。作为一种基于Empower的方法，所提出的工作流程易于在非监管和监管环境中部署，促进了脂质纳米颗粒载体和疫苗开发和生产中方法的高效开发和转移。