生物钟可以协调包括新陈代谢、激素产生、免疫和行为等有节律的生物过程，而长期的昼夜节律紊乱会导致代谢性疾病。组织对运动的敏感性和反应随一天内时间和生物钟的排列而异。虽然运动对能量代谢的主要影响已经明确，但运动时间是如何决定特定组织的代谢适应和全系统的组织协调目前尚不清楚。丹麦哥本哈根大学Juleen R. Zierath等团队基于代谢组学分析后肢肌肉的动静脉和肝脏等多个组织和血清的运动代谢图谱，以验证时间和运动依赖的运动因子的净摄取和释放，研究定时运动如何重新连接组织特异性和全身代谢，验证了2-羟基丁酸盐(2-HB)产生和分布的详细生理背景，从而揭示了运动对新陈代谢的益处，相关成果发表于Cell Metabolism。
运动时间决定代谢反应的幅度和类型
将两组小鼠分别放置在ZT3（早期光照/休息期）和ZT15（早期黑暗/活动期）的跑步机上进行1小时的运动或对照假运动，收集小鼠的血清、骨骼肌（腓肠肌）、肝脏、心脏、下丘脑（HT）、附睾白色脂肪组织（eWAT）、腹股沟皮下白色脂肪组织（iWAT）和肩胛间棕色脂肪（BAT）等组织（图1A）分别进行非靶向代谢组学分析，在上述组织和血清中发现了289种共有的代谢物（图1B）。PCA分析显示了时间（ZT）和干预（运动与久坐）对不同组织代谢组的影响（图1C）。每个组织根据运动时间都表现出独特的代谢反应（图1D）。对于肌肉组织来说，ZT15运动改变了197个代谢物，而ZT3运动仅影响了52个代谢物。在肝脏中，ZT3和ZT15运动分别影响了129和143个代谢物。eWAT中代谢物通常在ZT3运动时减少，但大多数会因ZT15运动而增加。因此，运动对代谢物具有时间依赖性和组织特异性影响。根据代谢物种类的变化（图1E），氨基酸（AAs）和脂质受ZT15运动的影响更大，而ZT3运动对肝脏脂质影响较大。作者还观察到ZT3和ZT15运动后皮质酮、葡萄糖、吲哚乳酸等的变化，突出了营养状况如何随着时间推移而变化，运动依赖的能量代谢如何相应变化。
图1. ZT3或ZT15运动后不同样本中代谢物的变化
代谢途径的系统性激活与定时运动的代谢反应
为了确定运动影响了哪些代谢途径，对显著改变的代谢物进行KEGG富集分析（图2A）。ZT15运动的小鼠血清中核苷酸和AA代谢高度富集，表明蛋白质降解和AA利用的增加（图2B）。肌肉的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸和酪氨酸的代谢在ZT15运动时增加，但在ZT3时没有改变。而肝脏中甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸的代谢水平不仅在ZT15运动后被富集，在ZT3运动后肝脏AA也同样被显著富集。因此，肝脏AA的产生和利用可能因运动时间不同而异。
运动时间如何调节全身脂质通量，检测了与FAs、甘油和酰基肉碱相关的代谢物水平。ZT3运动可诱导肝脏中FAs的变化和甘油代谢产物增加，而在ZT15时运动可提高血清、eWAT和iWAT中的FAs，且iWAT中甘油代谢产物的升高更为明显(图2E-F)。因此，ZT3运动会刺激肝脏的脂解，而ZT15运动刺激了WAT中的脂解。肌肉和血清中的酰基肉碱水平在ZT15运动后增加得更多，这表明在ZT15运动时激活了肌肉中的脂肪氧化及更高的非糖酵解来源的能量需求（图2G-H），并在基因表达谱上得到了验证。
图2. 运动对代谢的时空影响
运动重塑了组织内和组织间的代谢物关联性
通过所有代谢物的配对相关性图提示运动主要增强了血清、心脏、肝脏、肌肉之间的相互作用（图3A）。结合所有组织构建无向条件特异性相关网络(图3B)可知，久坐组和运动组有类似数量的节点和边。运动后发现更多的跨组织相关性（图3C），肝脏和eWAT内的代谢物连接性增加，强调了其作为代谢枢纽的突出作用（图3E），具有最高连接性的节点是不同条件下的主要分流点（图3F）。运动增加了参与AA和脂质代谢的代谢物之间的连接性，而降低了色氨酸分解代谢物和神经毒素喹啉、N-乙酰甘氨酸及多种FA和甘油磷脂的连接性。
图3. 运动重塑了组织内和组织间的代谢关联性
ZT15运动选择性增强骨骼肌-肝脏24h组织相关性
肌肉和肝脏是运动和禁食期间参与能量稳态的主要器官。在久坐状态下，肝脏和肌肉的相关性较小，在ZT3运动时相关性最小（图4A-B）。运动增加了脂质、AAs、核苷酸和碳水化合物之间的时间相关性，在ZT15时相关性更大。通过构建24小时相关网络分析运动如何以时间依赖的方式增加组织间的整体代谢物连接性（图4B）。大多数节点在不同条件下是共同的，而边的差异较大（图4C）。节点度和连接性在ZT15运动后有所增加（图4D），表明代谢物反应和网络连接具有明显的时间差异（图4E）。综上，揭示了组织内和组织间的代谢是如何对一天中不同时间的运动做出不同的反应。
图4. 运动时间决定肌肉-肝脏24小时时间相关性
运动诱导代谢物的时间和组织依赖性
已建立的运动因子包括乳酸、γ-氨基丁酸、3-氨基异丁酸、犬尿氨酸、犬尿酸、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸和α-酮戊二酸存在明显的基线、运动时间和组织依赖性差异，在ZT15时反应更大（图5A）。ZT15运动似乎优先引导骨骼肌S-腺苷甲硫氨酸（SAM）代谢转向腺嘌呤核苷酸补救、与谷胱甘肽（GSH）产生相关的转硫途径及细胞溶质NAD+/NADH的维持（图5B-C）。ZT15运动降低了肌肉、肝脏和心脏中的SAM水平，并且肌肉腺嘌呤和5′-AMP仅在ZT15运动时增加。5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）的活化可促进腺嘌呤转化为AMP。在ZT15时，肌肉中PRPP在久坐状态下增加，而在运动时减少。通过激活AMPK的免疫印迹分析证实了该代谢信号的特异性（图5D），表明在肌肉内运动诱导的腺嘌呤核苷酸挽救以一种时间依赖的方式进行局部调节。为了阐明运动对骨骼肌AMPK的时间依赖性激活，在葡萄糖缺失或存在下对肌管进行电脉冲刺激（EPS），并用LC-MS测量腺嘌呤核苷酸和腺苷（图5E)。发现在葡萄糖消耗条件下，EPS促进了AMP的产生，在葡萄糖匮乏的条件下，EPS减弱ATP再生，可见ZT15运动增加了肌肉AMP水平和AMPK激活(图5C-D)。2-HB被认为是肝脏中NAD+/NADH比值的特异性生物标志物，运动诱导2-HB积累受细胞质氧化还原失衡和能量应激等多种因素的影响。
图5. 维持细胞溶质NAD+/NADH间的组织和时间依赖性关系
时间和运动依赖性动静脉代谢物平衡
为了解组织间代谢物的动态交换，分析了不同时间运动小鼠后肢肌肉和肝脏动静脉（A/V）差异（图6A, B, D），及代谢偶联过程有关的组织间代谢物流动方向（图6E）。ZT3运动后相关性增加主要是由肌肉和肝脏之间的代谢物交换驱动的。肝脏和肌肉是唯一在ZT15运动后显示葡萄糖浓度降低的组织，在久坐状态下肝脏的葡萄糖也会降低。因此假设在ZT15运动后，肝脏的葡萄糖产生和释放不足以维持葡萄糖水平和满足增加的能量需求，A/V数据证实ZT15运动后全身葡萄糖降低（图6F）。
支链氨基酸（BCAA）在ZT3久坐和运动、ZT15久坐时显示出肝脏的净释放。只有异亮氨酸在ZT15运动后显示出肝脏的净释放（图6G）。在ZT15运动后，循环BCAAs达到最高，但肌肉中的净BCAA平衡没有改变。
除了ZT15运动，肝脏在所有条件下都显示净乳酸释放，而肌肉仅在ZT15运动后显示出净乳酸释放（图6H）。A/V数据还显示了循环代谢物浓度的区域差异。在久坐小鼠中，ZT15在门静脉中丁酸盐/异丁酸盐水平最高（图6I）。尽管肌肉中相对浓度远低于门静脉，但在ZT15运动后是丁酸/异丁酸的净输出者。
图6. 肝脏和肌肉的动静脉对定时运动反应的差异
2-HB在全身和局部组织代谢中的时间依赖性作用
2-HB/2-羟基异丁酸盐以时间和运动依赖的方式连接代谢物并作为中枢全身代谢枢纽， ZT15运动后肝脏和肌肉中的内源性2-HB显著升高（图7A），且与其它羟基丁酸和糖尿病的生物标志物高度相关，与己糖呈负相关（图7B）。为了解运动对2-HB的动态影响（图7C），作者比较了久坐组与定时运动组小鼠的数据。血清、肝脏和肌肉中的2-HB水平在24小时内均发生波动，在ZT3时水平较低，而ZT15时高出2-4倍。
除ZT15运动时2-HB水平最高外（图7D），在所有条件下肝脏的净释放量均显著。2-HB的肌肉净摄取仅在ZT3久坐时显著，此时全身水平最低。接下来在不同时间给小鼠注射不同剂量的氘代2-HB以探究其作为信号分子的作用（图7E）。收集组织并使用基质辅助激光解吸/电离质谱成像监测2-HB的生物分布及其对代谢的影响，发现在肝脏和肌肉中外源性2-HB以剂量和时间依赖性存在（图7F-I）。
为了研究2-HB在全身代谢中的作用，对小鼠注射未标记的2-HB，通过间接量热法监测能量消耗（EE）和呼吸交换比（RER）（图7J）。高剂量（10 mmol/kg）2-HB在注射30 min内可急性短暂抑制EE（图7K）。RER在夜间急剧下降（图7L），并在几个小时内保持低水平，表明葡萄糖氧化向脂质利用转变。在ZT3和ZT15注射60 min后血糖显著升高（图7M），表明2-HB可抑制全身葡萄糖利用。因此，时间和运动依赖性的代谢物如2-HB可能在能量应激条件下传递能量状态，并影响组织代谢和系统能量平衡。
图7. 验证2-HB是一种时间依赖性运动因子
小结
本研究通过代谢组学绘制和比较了7种不同小鼠组织和血清在一天中不同时间进行急性运动后的整体代谢物反应，结合后肢肌肉的动静脉和肝脏采样，以验证时间和运动依赖的运动因子的净摄取和释放，提示一天中特定时间运动的局部和全身代谢反应。上述全面的运动代谢图谱突出了时间依赖性运动代谢产物2-HB的产生和分布，阐明了定时运动如何重塑组织特异性和全身代谢，研究增加了关于特定时间运动对系统代谢和组织串扰影响的重要观点。运动期间骨骼肌和肝脏代谢物的产生和消耗随时间而变化，2-HB作为系统性“运动因子”发挥重要作用，研究绘制的代谢图谱将有助于加深对运动多效性的理解，揭示运动对代谢健康益处的机制。
参考文献
Atlas of exercise metabolism reveals time-dependent signatures of metabolic homeostasis. Cell Metabolism. 2022.
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