图1 文献网站截图
Sophie等法国波尔多大学研究人员在22年底发表了研究论文《Perfusion process for CHO cell producing monoclonal antibody: comparison of methods for determination of the optimum cell specific perfusion rate》，他们使用表达IL-8抗体的CHO细胞系，对比了三种不同的细胞培养方法，即PTL（push to low）、PWB (perfusion no bleeding) 和SP (semi-perfusion)，来确定灌流培养的关键操作参数。同时，从整体细胞代谢产物的稳定性角度比较了这些方法，并基于结果优化了灌流培养的开发步骤。该文献发表在杂志《Biochemical Engineering Journal》上。[1]
细胞株和培养工艺优化
随着生物制药技术的飞速发展，在罕见病、免疫疾病和肿瘤领域，抗体药物、细胞因子、疫苗和各种生物活性蛋白等生物制品在诊断和治疗中应用日益广泛。明确的临床需求给生物药工业化生产带来了挑战。目前用于工业化生产的哺乳动物细胞株主要有中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、仓鼠胚肾细胞(BHK)、小鼠骨髓瘤细胞(NS0和SP2/0)，还有一些人类细胞株，包括HEK293和HT-2080。其中CHO细胞株为人熟知，应用最为广泛。[2]
而目前常用的哺乳动物细胞培养工艺有：批次培养、补料批次培养和灌流培养。（表1）由于哺乳动物细胞扩增时间长、代谢途径复杂、对外界环境敏感性强、对营养要求苛刻，且培养过程中细胞状态容易改变，生产人员需要对培养工艺进行持续优化。
表1 哺乳动物细胞培养工艺[3-8]
白细胞介素IL-8
白细胞介素是一组参与多种免疫应答过程的细胞因子。由于最初发现是由白细胞产生又在自细胞间发挥调节作用，所以由此得名。目前发现有40多个成员，形成了一个蛋白家族，在人类基因组中大约有50个不同的编码基因。[9]
由于白细胞介素会部分参与抗炎反应，因此科学家正开发特异性抗体来捕获白细胞介素。IL-8由表达Toll样受体的细胞分泌，这些受体参与固有免疫应答。此前，IL-8抗体已被研究人员用于腺癌的治疗[10]，因此IL-8抗体将可能是补充治疗这类癌症的手段，以及治疗重症新冠病人的潜力药物。
Maurice助力细胞培养工艺优化
研究人员将单抗样本在10 mM pH 7.4的磷酸钠溶液中透析，稀释至0.2 mg/mL浓度。接着保存于含0.35%甲基纤维素，4%两性电解质pH 3-10，10 mM精氨酸，10 mM亚氨基二乙酸和2 M尿素 (最终浓度)的缓冲液中。采用pI marker 8.40和9.99作为内标。采用280 nm吸光度值对各个样本进行检测和定量。
图2 不同培养条下蛋白质大小和变异体丰度
结果如下，测得样本的pI范围为8.83-9.24，主峰的pI为9.12。（图2）培养条件优化并未导致新的电荷变异体出现。然而，对每个批次的电泳图进行比较，发现相同的峰以不同的比例被检测到。(表2)
表2 不同培养条件下样本icIEF检测结果
之前的一些研究表明，灌流培养时样本酸性电荷变异体水平较低，酸性变异体通常由脱酰胺、糖基化或糖基化调节触发。在哺乳动物细胞培养过程中，样本的糖基化部分是由还原糖诱导的，而还原糖是培养基中的主要能量来源。
研究人员指出，在灌流培养条件下，葡萄糖浓度可以维持在较低的水平。在灌流培养C40中，葡萄糖浓度稳定在0.15g/L时，样本可以降低糖基化，从而解释了酸峰含量减少的原因。此外，较低的废物和细胞裂解物积累，以及灌流条件下较低的样本暴露，也可能导致较低的蛋白质脱酰胺和酸性变异体。
Maurice双模式符合2020药典
Maurice协助研究人员表征了不同培养条件下IL-8抗体的电荷变异体，使得科学家推测了电荷变异体产生的原因，推导了工艺优化的方向。
Maurice全自动蛋白质表征系统是大分子蛋白质药物分子量大小和电荷变异体的金标准，同时具备CE-SDS和icIEF两种检测模式，双模式皆符合2020版药典。
图3 Maurice特点
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参考文献
[1]Sophie M et al. Perfusion process for CHO cell producing monoclonal antibody: comparison of methods for determination of the optimum cell specific perfusion rateDecember 2022.Biochemical Engineering Journal 191:108779
[2]张琼琼, 方明月, 栗军杰,等. 哺乳动物细胞灌流培养工艺开发与优化[J]. 生物工程学报, 2020, 36(6):10.
[3] Bielser JM, Wolf M, Souquet J, et al. Perfusion mammalian cell culture for recombinant protein manufacturing-A critical review. Biotechnol Adv, 2018, 36(4): 1328-1340.
[4] Hong J, Demirji J, Blackstock D, et al. Development of an alternating tangential flow (ATF) perfusion-based transient gene expression (TGE) bioprocess for universal influenza vaccine. Biotechnol Prog, 2019, 35(5): e2831.
[5] Karst DJ, Steinebach F, Soos M, et al. Process performance and product quality in an integrated continuous antibody production process. Biotechnol Bioeng, 2017, 114(2): 298-307.
[6] Pollock J, Ho SV, Farid SS. Fed-batch and perfusion culture processes: economic, environmental, and operational feasibility under uncertainty. Biotechnol Bioeng, 2013, 110(1): 206-219.
[7] Xu S, Gavin J, Jiang RB, et al. Bioreactor productivity and media cost comparison for different intensified cell culture processes. Biotechnol Prog, 2017, 33(4): 867-878.
[8] Bielser JM, Chappuis L, Xiao YS, et al. Perfusion cell culture for the production of conjugated recombinant fusion proteins reduces clipping and quality heterogeneity compared to batch-mode processes. J Biotechnol, 2019, 302: 26-31.
[9]C. Brocker, D. Thompson, A. Matsumoto, D.W. Nebert, V. Vasiliou, Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family, Hum. Genomics. 5 (2010) 30–55.
[10] Y.Y. Yako, D. Kruger, M. Smith, M. Brand, Cytokines as biomarkers of pancreatic ductal adenocarcinoma: A systematic review, PLoS One. 11 (2016) 1–33.
*部分资料来自于文献和网络
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