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mRNA疫苗技术突飞猛进
全球肆虐的新冠疫情促使美国FDA于2021年8月和2022年1月完全批准了两款新冠疫苗，分别是辉瑞/BioNTech合作开发的Comirnaty（BNT162b2）与Moderna公司开发的Spikevax（mRNA-1273）。这2款疫苗都是mRNA疫苗。mRNA疫苗的获批在全球市场掀起了一股热潮，一方面药企不仅获得颇丰的营收，另一方面mRNA疫苗技术也受到行业、媒体和投资者颇多关注。[1]
灭活疫苗是经典第一代疫苗，第二代疫苗则是即亚单位基因工程疫苗。而mRNA疫苗属于第三代疫苗，即核酸疫苗。在所有的疫苗种类中，新冠mRNA疫苗极快的研发速度和临床有效性引起了广泛关注。经历疫情，该技术领域取得了突飞猛进的发展。
图1 mRNA疫苗作用原理（以LNP为例）来自网络
mRNA疫苗的主要特点[1]
①安全性优势：mRNA仅在细胞质中表达，避免整合基因组的风险，表达效率高、半衰期短，体内存在天然代谢降解机制；
②靶点数量优势：很多难成药的蛋白质或胞内蛋白均可由mRNA编码表达。可分泌至胞外、靶向受体或循环系统，靶向性选择更加丰富；
③疗效优势：各种修饰使mRNA更加稳定，可高度平移。通过将mRNA配制成载体分子，可以实现高效的体内递送，使其在细胞质中快速表达；
④制造工艺优势：mRNA通过体外转录过程合成，可高效率、低成本、大规模生产。
表1 mRNA疫苗与传统疫苗对比
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曾经卡脖子的“递送途径”
mRNA属于带负电的生物大分子，很难透过同样带负电的细胞膜进入细胞发挥疗效。此外，它们易被核酸酶降解，难以完整地到达靶标部位。因此mRNA需借助相应的递送系统，才能将RNA药物传递到相应的治疗部位。[2]
图2 mRNA疫苗递送机制（以LNP为例）来自网络
mRNA如何避免在表达前降解是最关键的，因此递送系统就显得尤为重要。目前应用最多的递送系统为脂质纳米颗粒（LNP），其他递送系统包括脂质多聚合物（LPP）、聚合物纳米颗粒（PNP）、无机纳米颗粒（INP）、阳离子纳米乳（CNE）等。
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LNPs的质量分析是关键
鉴于mRNA疫苗重要性日益增加，世界卫生组织(WHO)提出了新的指南，重点关注mRNA疫苗的相关特性，以评估mRNA疫苗的质量、安全性和效力。[3]为了做好质控，疫苗生厂商需要使用可靠的分析方法来鉴定工艺相关杂质、确认产品含量和产品效力。第一步需要鉴定疫苗产品的特征，以确定疫苗的关键质量属性(CQA)，从而决定关键工艺参数(CPPs)、关键材料属性(CMAs)、经验证的工艺参数范围(PAR)和质控策略(CS)。
表征LNPs的颗粒大小、表面电荷、脂质组成、颗粒形态和表面疏水性很重要，因为不同的LNPs可能有很大差异。同时，这些特性对疫苗的效果会产生影响。例如，LNPs的表面电荷与细胞毒性相关。带正电的LNPs的优势是它们可以更好地与带负电的胞膜表面相互作用，这对免疫激活和细胞摄取至关重要；然而，带正电的LNPs的缺点是可能具有一定毒性，例如促炎症作用。
2022年8月，德国布伦瑞克工业大学和CureVac研发团队使用了ProteinSimple旗下的Maurice全自动蛋白质表征系统，开发了两种针对LNP递送的mRNA疫苗icIEF检测方法，该研究成果发表在《ELECTROPHORESIS》上。[4]两种方法各有优点，共同助力mRNA疫苗的质量和稳定性研究。此外，这两种方法不仅结果具有高重复性，还可以灵活地针对不同的LNPs进行优化。
结果展示
方法A
缓冲液使用9M尿素，icIEF图谱显示出两个较宽且锯齿状的峰。当进行稳定性测试时，峰的形状发生了很大变化，因此可以得到关于稳定性的详细信息。
此外，由于单个LNPs内mRNA分子数量不同，icIEF峰型也有相应变化。两个峰的峰面积总和与mRNA含量呈线性关系，这取决于LNPs的大小(RSD为2% ~ 8%)。这一点在研究团队使用纳米粒度分析的检测中得到了证明。
方法B
缓冲液使用5.5 M尿素和2M乙基脲的混合物。该方法具有pI值重复性高的特点(<0.5%)。与方法A类似的是，结果重复性高，峰面积(2%-7%)与mRNA含量线性相关。样本的稳定性测试可以通过pI值和峰面积的变化体现。在方法B中，粒径对峰面积似乎没有显著影响。（两种方法使用的缓冲液配方可参考文献原文）
表2 方法A和方法B测得的峰面积
图3 方法A的icIEF谱图
(A)第1批次，(B)第1批次在5℃保存1周
(C)脂质纳米颗粒(LNP)安慰剂，(D)第2批次
图4 方法A的icIEF谱图
(E)第1批次在5℃保存4周
(F)第1批次经过10个冻融循环
(G)第1批次±20%阳离子脂质
(H)第1批次±20%聚乙二醇(PEG)脂质
图5 方法B的icIEF谱图
(A)第1批次，(B)第1批次在5℃保存1周
(C)脂质纳米颗粒(LNP)安慰剂，(D)第2批次
图6 方法B的icIEF谱图
(E)第1批次在5℃保存4周
(F)第1批次经过10个冻融循环
(G)第1批次±20%阳离子脂质
(H)第1批次±20%聚乙二醇(PEG)脂质
总结
对比以往的理化方法，icIEF的鉴定方法拥有以下优势：
①这两种方法(特别是方法A)能够通过研究不同储存时间和FTC次数（冻融循环）来表征LNP的稳定性，并区分不同的制剂类型，包括脂质成分的改变和批次间的差异。
②检测方法有较高的灵敏度。将样品在冰箱中储存1周后的测定结果可以看出，该方法在样品中有极小变化时，都能在检测结果中体现差异。
③未包封和已包封mRNA的LNPs可以通过icIEF方法明显区分。
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ProteinSimple全球市场mRNA技术领域的客户有Moderna、BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH、CureVac GmbH、Providence Health and Services、Translate Bio等。
Maurice全自动蛋白质表征系统是大分子蛋白质药物分子量大小和电荷变异体的金标准，同时具备CE-SDS和icIEF两种检测模式，双模式皆符合2020版药典。
图7 Maurice特点
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参考文献
[1]《2021年全球十大突破性技术 “流量密码”mRNA将如何蜕变？》
[2]《全球十大突破性技术：mRNA疫苗究竟是何方神圣？》
[3]WorldHealth Organization. Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations. Geneva:World Health Organization; 2021.
[4]Krebs F, Burger U, Dörks S, Kramer M, Wätzig H. Two quality and stability indicating imaged CIEF methods for mRNA vaccines. Electrophoresis. 2022 Oct;43(20):1971-1983. doi: 10.1002/elps.202200123. Epub 2022 Sep 15. PMID: 36004399.
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