Dr.赛流式小课堂 | 流式可固定活性染料

亲爱的同学，你知道吗？流式Panel中要有去除死细胞的荧光染料。

在检测细胞内细胞因子或细胞核内靶标时，PI和7-AAD是不够的，这要用到可固定的流式荧光染料！

使用Fixable viability dye时，染色液有什么要求？

当使用可固定的细胞活性染料时，Tris缓冲液和含有叠氮化钠或外来蛋白质的溶液不能作为细胞染色缓冲液，因为溶液中含有这些物质可能导致死细胞群染色强度的显著降低和/或活细胞群背景染色的增加。

流式实验中，利用LIVE/DEAD Fixable dead cell stain或者是Fixable Viability Dye 胺基反应染料鉴定死活细胞，需如何制备补偿单染管？

补偿样本中需要同时检测到阳性信号和阴性信号，我们提供两种方案：

1. 准备活细胞与死细胞的混合样本：将一份活细胞样本平均分成两份，一份不做处理，一份制备成死细胞，制备完成后将两份样本重新混合，再进行染色。制备死细胞的方法请参考如下描述：可以通过60°C放置20分钟热灭活细胞。或将细胞放入70%乙醇固定，乙醇固定的细胞可以保存在-20°C，使用前再取出。

2. 利用ArC™ 胺反应补偿珠试剂盒（货号A10346），该产品可与具有胺反应性的LIVE/DEAD Fixable dead cell stain或者是Fixable Viability Dye可固定死细胞染料结合，以用于流式补偿调节，而无需自己制备补偿样本。

Fixable Viability Dye流式染色结果如何解读？

相对于未染色的细胞，Fixable Viability Dye染色的细胞整体都会检测到荧光信号，但是可以通过信号的强弱来区分活细胞和死细胞。其中活细胞的细胞膜完整，仅细胞表面蛋白胺基结合了染料，呈现较弱的荧光信号；而死细胞的细胞膜通透性改变，染料能够进入死细胞，与细胞内和细胞表面蛋白上的胺基结合，因此死细胞呈现更强的荧光信号。（见图4）

我可以将流式Fixable Viability Dye染色的细胞通过荧光显微镜观察细胞死活吗？

不建议，该染料对基于成像的实验效果不好，由于所有细胞都被染色，很难通过显微镜从暗淡的活细胞中分辨出明亮的死细胞。