抗体偶联ADC分析与表征

抗体偶联药物(ADC)是一类新兴的生物治疗药物，由抗体、连接子和小分子细胞毒素三部分组成。与传统抗体药物相比，结构会更加复杂，其复杂程度受抗体种类、偶联方式、连接子与毒素种类等多个因素影响。因此ADC分析方法的建立具有特殊性，分析方法很难做到完全平台化，需要根据每类ADC的自身质量属性的特点进行差异化开发。随着越来越多复杂形式ADC分子的出现，如何合理且准确地看到ADC特有的各类质量属性将是未来的难点和挑战。本文就ADC分析与表征的基础技术做简要介绍探讨。

ADC产品关键质量属性（Critical Quality Attributes, CQA）举例如下图所示。根据先验知识和平台经验，与分子安全性和有效性相关的物理、化学、生物或微生物性质及特征，均可纳入关键质量属性，且需随产品开发阶段的进步而不断加深研究。ADC主要的关键质量属性包括一级结构、高级结构、纯度与杂质、载药量与药物分布（Drug-to-Antibody Ratio, DAR）、含量、效价以及其他必须的生物制品质量属性。

本文将从载药量与药物分布、游离药物、分子大小变异体和电荷变异体四个方面进行介绍，讨论各类分析技术是如何灵活配合用于表征分析ADC质量属性。

DAR及其分布 

DAR（Drug-to-Antibody Ratio），即药物小分子与抗体分子的数量比例，可指示平均每个抗体上偶联上的小分子药物个数。DAR与ADC的疗效和安全性直接相关，低载药量（低DAR）会降低ADC的效力，而高载药量（高DAR）会改变ADC分子的药代动力学和毒性。常规用于定量DAR的方法有光谱（UV-Vis）、色谱（HPLC）和质谱（LCMS）等。如下图所示，已上市ADC产品在DAR分析质控上主要是光谱和色谱这两类技术。

1. 光谱方法（UV-vis）

可实现DAR监控需要有如下三个前提条件：

1）有效载荷应含有紫外可见发色团；

2）有效载荷和抗体在其紫外可见光谱中应显示出不同的吸收峰属性； 

3）连接子-有效载荷的存在不影响ADC样品中抗体部分的光吸收性质。

 根据抗体部分和载荷部分的不同吸光度和消光系数，依据Beer-Lambert原理计算出DAR值及ADC浓度

2. 色谱方法（HPLC）

常见的可用于DAR分析的色谱方法有疏水色谱（HIC）和反相色谱（RP）。疏水色谱利用不同载药组分的疏水性质差异进行分离，不同的固定相（苯基、丁基、醚基等）具有不同的疏水性和选择特性，采用高盐浓度流动相使蛋白结合到固定相，继而降低盐浓度进行洗脱，这种温和的结合与洗脱条件可以保持ADC药物的天然构象。HIC是可在完整分子水平上监控DAR的最佳方法，可直接定量不载药抗体（DAR0）组分，一般认为D0为非有效组分且会占据ADC结合位点影响ADC内吞。

反相色谱（RP）利用目标分子之间的极性差异进行分离，分离度较好，且方法本身质谱兼容，可直接进行不同载药形式的分子量定性。反相方法也可直观看到小分子药物在不同位点的分布情况。如下图所示，对于常规链间二硫键巯基偶联的ADC分子，由于高载药异质性，需对样品进行还原后再进行分析，目标物非完整状态，虽然可以监控药物在不同位点的分布，但无法定量完整的不载药抗体DAR0的比例。

3. 质谱方法（LC-MS）

 质谱方法是另一种常用的DAR分析技术。目前使用电喷雾电离(ESI)与飞行时间(TOF)或具有更大质量范围的Orbitrap可以以足够的分辨率区分ADC的异质分子物种。例如，在还原和非还原条件下，通过完整的质量测量，可以获得ADC分子的完整质量分布。

以上三种常规分析技术拥有各自的优点和最佳应用场景，可按照ADC分子特点和所处的开发阶段，按需开发或配置相应的DAR定量方法。

游离药物 

所有ADC共有的一个重要质量属性是游离(未结合)药物的数量，这会引起对毒性和潜在安全问题的关注。未偶联药物或药物相关杂质的残留量可能残留在最终产品中。未偶联药物的相关形式，如连接药物种类或其他降解产物，也可以在偶联物存储期间释放。因此，开发和应用合适的方法来检测、表征和量化游离药物是至关重要的。常规的游离药物监控方法的开发思路如下。

分子大小变异体 

分子大小变异体(聚集体、片段等)是重要的质量属性，可直接影响蛋白质疗法的疗效或安全性。聚集是蛋白质最常见的物理降解途径，且ADC比抗体更容易聚集，主要是因为药物/连接子分子的存在，使连接位点的局部表面具有更多的疏水性。与抗体分析的技术一致，体积排阻色谱（SEC）、光散射（SEC-MALS）等常规技术可用于支持ADC分子聚合体的分析表征，非还原/还原毛细管电泳（non-reduced/reduced Capillary Electrophoresis）可用于支持ADC片段的分析表征。

电荷变异体

与抗体一致，ADC的电荷变异体是关键的质量属性，因为它们对稳定性和生物活性有潜在影响。在ADC中可以观察到各种形式的与电荷相关的异质性，贡献这些异质性的因素包括抗体自身展示的电荷变异性、偶联工艺过程引入的修饰、小分子药物本身的结构以及在不同偶联位点引起的电荷变化等。常规分析技术如离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，IEX）或者等点聚焦电泳（iCIEF）可以实现电荷变异体的监测。常规的电荷变异体表征策略也适用于ADC分子，富集单一变异体组分后，进行完整水平（Top-down）、亚基水平（Middle-down）或肽段水平（bottom-up）质谱解析。