No.1
Ct值出现太晚or Ct值偏大，甚至无Ct值？
01
目标模板浓度太低
在qPCR 中体现为CT值偏大，复孔重复性不佳。
可能的原因1
基因表达丰度低
优化建议：选择高灵敏度、荧光信号强、更宽动态范围的qPCR试剂对付低丰度模板；
可能的原因2
模板稀释过度
优化建议：提高模板浓度(浓缩)，减少模板稀释度（理论上每稀释10倍，CT 值大 3.3）；
可能的原因3
模板有降解
优化建议：重新制备模板，注意选择好的RNA纯化Kit，避免RNA降解，优化逆转录条件。
02
扩增效率异常
扩增效率偏离100%±10% 应考虑优化。Ct值出现太晚的潜在原因之一是扩增效率低，导致效率低的原因可能有
可能的原因1
反应条件未优化
优化建议：可以在同一实验中预设不同退火温度，选择Ct值较小且平台期荧光强度最高的那个温度；
可能的原因2
存在PCR反应抑制剂
优化建议：一般反应抑制剂多为模板带入，可考虑重新制备模板或者稀释模板从而降低抑制剂水平；选择反应性能强健、更耐受抑制剂的试剂有助于减少此类因素影响；
可能的原因3
模板扩增区域有复杂二级结构，高GC含量，影响扩增效率
优化建议：同一目标设计多个扩增区域/避开二级结构复杂的区域；选择性能强健耐受性高的预混液，都是可行的解决方法。
03
PCR产物过长影响扩增效率
优化建议：
缩短PCR产物长度，控制在100 bp-150 bp之内
优化建议：
尝试标准的三步扩增提高扩增效率
优化建议：
加长延伸时间使得反应完全，以提高扩增产量
04
无Ct值
可能的原因1
循环数不够
优化建议：一般反应设置为40个，必要时可增加到45个循环；
可能的原因2
信号采集设置不当
优化建议：两步扩增一般将信号采集设置在退火延伸阶段，三步扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。探针法通常在退火结束时或延伸结束时采集信号。
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No.2
重复性差，一致性差怎么破？
01
样本重复性差
优化建议：
取材部位/处理方式&时间应严谨地保证一致；选择稳定可靠的试剂盒进行样本制备（如RNA纯化尽量选离心柱，带去除gDNA的）、提取后对RNA的完整度和纯度进行检验，减少样本质量重复性差。
02
技术重复性差
分为复孔重复性差（复孔之间ΔCt<0.5就算重复性良好）以及不同反应次跑的板间重复性差两种。
排查方向有以下——
1
模板浓度低容易出现复孔重复性差，若同时Ct值偏大，可尝试提高模板量。条件允许的话，增加复孔数，弃掉偏差大的值也是好办法。
2
加样误差是同时影响孔间和板间重复性的常见原因。良好的操作习惯有助于提高实验重复性，包括：定期校准加样器能减少不同时期之间的加样体积偏差；选择使用预混液能减少加样误差影响孔间重复性；低吸附耗材能减少试剂挂壁；稳定的操作环境温度，反应前充分混匀样品和试剂和离心除气泡避免影响读数，都有助于减少孔间差异和板间差异。注意仪器上不同位置的孔温度一致性也可能影响孔间一致性。
3
试剂的配液稳定性也值得重视。有时候，配置好的反应板不一定能马上上机，等待时长难以确定，导致板间误差过大——若预混液能保持足够长时间的稳定性，可确保第一个检测板的结果与最后一个检测板的结果相匹配，同时还能提高工作流程的整体便利性。
4
试剂的批间一致性是影响重复性、实验前后可比较性的重要因素。定量PCR反应体积很小且灵敏度高，不同批次试剂的痕量偏差都可能影响结果稳定。尽量选择同一批次/批号的试剂，选择信誉可靠、批间一致性高的产品，有助于提高实验重复性和结果可比较性。
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No.3
熔解曲线不是单峰曲线？
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用SYBR Green可以通过测熔解曲线来分析确认反应产物特异性，熔解曲线是随温度升高DNA双螺旋结构解开程度的曲线：单尖峰提示产物只有一种；多峰则提示有不止一个产物，比如引物二聚体或者非特异扩增。
排查方向有以下——
01
引物二聚体
排查特征：
电泳检测有小于100 bp的扩散条带；熔解曲线中杂峰Tm在75℃附近的多为引物二聚体（80℃之前）
优化建议：
适当降低引物浓度，或增加模板浓度；优化扩增条件提高退火温度（建议用梯度PCR摸索最佳Tm值）
02
非特异扩增
排查特征：
电泳检测；杂峰Tm值在80℃之后，目标峰之后的多为非特异扩增；
优化建议：
引物设计特异性不好或者模板质量不佳（如含有基因组污染）都可能导致非特异扩增
——建议考虑重新设计引物或者重新制备模板（记得在RNA纯化中用DNase处理降解gDNA）
另外，非特异扩增也可能来自反应退火开始前各种非特异延伸，和“实验室某个角落or空气中的前任、前前任qPCR” DNA污染！带有UDG和dUTP配方设计的预混液可一步消除掉这类非特异产物；再加上抗体暂时封闭酶活的热启动设计，既能防止退火前的非特异反应，又能在退火同时迅速释放酶活，让反应更快速高效率。
Tips:
1
熔解曲线不理想还可尝试两步法，因为二步法扩增特异性高。
2
单峰Tm值在80℃之前考虑没有模板的可能性
3
单峰不尖要考虑可能有大小接近的非特异扩增
4
Mg2+离子浓度超过3mM以上则易形成引物二聚体，选择一管全包条件已优化的预混液就不用考虑
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A
兼顾高灵敏度和高特异性：
保障检测的特异性同时具有更小的Ct 值，最低检出限5拷贝
B
高强度荧光信号：
更大的扩增曲线dRn值，更高的平台期荧光信号
C
宽动态范围：
可在跨6个对数级动态范围内进行精准检测，并确保可靠的线性
D
桌面稳定性高：
配置好的qPCR反应体系可以在室温下稳定保存72小时
E
批间一致性高：
生产过程遵循ISO 9001质量管理体系，保证数据的稳定性和重复性
F
抗残留污染：
采用UDG和dUTP配方，杜绝残留扩增产物污染造成的假阳性结果
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