qPCR作为一项基础的分子生物学实验，在生命科学研究中有着非常广泛的应用。由于qPCR实验中的影响因素众多，稍有不慎就会导致定量结果异常。本文特别整理了qPCR实验过程中的要点和注意事项，希望能够帮助大家取得理想的定量结果。
实验设计
01
如何设置重复和对照？
qPCR实验通常需要设置三个生物学重复，对于不同的实验处理，还要有3个技术重复。
● 生物学重复：同一处理下的不同植株、细胞系、动物个体等。
● 技术重复：同一实验材料所包含的复孔。
实验对照是实验的监控系统，用以监测实验是否存在异常。在qPCR实验中，实验对照通常有NTC对照和NRT对照。
● NTC：无模板对照，用来验证实验材料是否被污染或是否存在引物二聚体，一般用水做模板。
● NRT：采用未经反转录的RNA做模板，以检测gDNA的残留情况。
02
如何选择内参基因？
在进行相对定量PCR实验时，需要选择合适的内参基因对不同样本的基因表达水平进行校正。
常用的内参基因包括Actin、GAPDH、18S rRNA等。内参基因的选择可参考已发表文献或通过具体实验来筛选；也可通过内参基因数据库来检索，如中科院内参基因数据库（ICG http://icg.big.ac.cn/），里面涵盖了200多个物种的内参基因信息。
反应体系的配置
01
cDNA是否可测浓度？是否需要稀释？
反转录获得的cDNA体系比较复杂（包含引物、dNTP、Buffer等多种成分），其中的部分成分在OD260处同样有吸光值，反转录后直接用产物测量无法获得准确的cDNA浓度。
对于高丰度基因，在定量时可将cDNA稀释4-10倍；低丰度基因不建议稀释。在不确定基因表达丰度的情况下，可将cDNA做梯度稀释，然后根据定量Ct值确定最佳稀释度。
02
引物浓度该如何确定？
引物纯度对反应特异性影响很大，建议使用PAGE纯化级别以上的引物。收到引物干粉后需根据说明书将引物稀释配制成100 μM的母液分装保存，实验时将母液稀释至10 μM再使用。引物终浓度为0.3 μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。如需进一步优化，可以在 0.2-0.5 μM范围内调整引物浓度。
03
ROX染料该如何正确使用？
ROX是一种惰性参比染料，不参与PCR反应。ROX作为阳性参比，可对其它荧光信号进行归一化，以校正孔间差异。使用不同qPCR仪时ROX染料的用量不同。
常见仪器的最适ROX染料浓度
实验操作要点
规范的实验操作对于获得理想的qPCR结果非常关键，该视频以TIANGEN FastFire快速荧光定量试剂（FP207）为例，从实验准备、方案设计到完整的实验操作，以及结果评价等方面都做了详细的介绍，助您避开qPCR操作雷区，获得理想实验结果！
Tips：提高复孔间重复性的方法
√ 试剂使用前要充分混匀：如果试剂没有混匀，将影响反应性能。使用时请上下颠倒轻轻混匀，不要使用振荡器进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。
√ 配制预混体系：以减少复孔间的误差，通常先将cDNA以外的组分配制成预混液，然后将预混液分装至每个反应管中，最后将cDNA单独加入每个反应管中。此外，上机前需要通过离心将管盖、管壁上的试剂离至管底，并去除反应管中的气泡。
√ 正确使用移液器：吸取取样本时枪头深入液面的深度尽量一直保持在1-2mm之间，避免外壁沾有过多试剂并随加样进入反应管中，导致重复性不好。小体积试剂加样时，取液后注意观察是否取到液体，弃吸头前眼观确定吸头中无残留。
反应条件的选择
01
选择两步法还是三步法？
实验时可参照荧光定量反应试剂说明书来设置反应程序。一般建议采用两步法PCR反应程序进行实验，若因模板量较低等因素导致扩增效果不佳，可调整为三步法反应程序。
02
退火温度如何设定？
通常引物退火温度比引物的解链温度(Tm)低5℃，如果引物碱基数较少，可适当提高退火温度，提升PCR的特异性；如果碱基数较多，可适当减低退火温度。建议先采用说明书推荐的退火温度，如需进一步优化，可以尝试在原退火温度上下5℃范围内进行调整。
定量结果判读
对于染料法荧光定量，我们一般通过扩增曲线、熔解曲线来衡量qPCR结果的好坏。
扩增曲线
扩增曲线应为平滑的S型曲线，能够到达平台期。阳性样本的Ct值在15-30之间；NTC样本无扩增曲线或Ct＞35；复孔间Ct值之差小于0.5或STD＜0.2。
熔解曲线
熔解曲线有单一锐利的峰，Tm值在80-90℃之间，NTC样本无目标基因峰。
首页
