近日，四川大学华西医院疾病系统遗传研究院张勇团队在《Analyst》发表题为“Characterization of site-specific N-glycosylation signatures of isolated uromodulin from human urine ”的研究成果。该研究优化了尿调节蛋白（Umod）分离和完整N-糖肽分析方法，并将该方法用于IgA肾病（IgAN）患者和健康对照组来筛选IgAN的新型生物标志物。青莲百奥为该研究提供糖基化质谱分析。
研究背景
尿调节蛋白（Umod，又称Tamm-Horsfall蛋白）仅在肾脏产生，是尿液中含量最丰富的N-糖蛋白，并形成可拮抗尿路致病菌粘附的细丝。Umod发挥着多种关键作用，血压控制、先天免疫系统的激活、防止肾结石形成以及生理和疾病条件下的尿路感染（UTIs）等。Umod含有8个潜在的N-糖基化位点，具有高度糖基化作用。糖基化占Umod分子量的30%，对其功能尤为重要。然而，由于缺乏合适的分离和分析方法，目前对Umod在健康个体和IgA肾病（IgAN）患者中的位点特异性N-糖基化特征仍然知之甚少。
研究策略
提出了一种基于硅藻土吸附的简单快速分离Umod的方法。使用开发的EThcD-sceHCD-MS/MS对HILIC富集或不富集的完整N-糖肽进行分析。
将该方法用于检测IgAN患者(n=9)和健康对照组(n=9)中Umod的N-糖基化，绘制Umod位点特异性N-糖基化图谱，并揭示其在IgAN患者中的变化。
研究结果
一、实验方法优化
作者首先优化了人尿液中Umod分离方法，利用硅藻土可以选择性吸附Umod蛋白并且在低离子强度环境中诱导形成凝胶状态，因此吸附的Umod又能够轻松地被去离子水解离。分离工作流程主要包括富集、洗涤和洗脱，并通过蛋白质印迹法验证了该分离方案的特异性和可重复性。利用优化的方法从健康志愿者的新鲜尿液中分离出Umod，为了更多的检测出潜在的N-糖基化位点，作者进行了HILIC富集并开发EThcD-sceHCD-MS/MS（混合解离技术，ETHcD-sceHCD技术）分析完整的N-糖肽（图1A）。最终明确7个N-糖基化位点（N38、N80、N232、N275、N322、N396、N531）（图1B）。此外还分析了鉴定出的N-聚糖组成，大多数N-聚糖属于复合型。只有15个和13个N-聚糖分别属于高甘露糖型和杂交型（图1C）。另外，51.0%和43.7%的N-聚糖分别被岩藻糖基化和唾液化，27.2%的N-聚糖同时被岩藻糖基化和唾液化（图1D）。这些结果表明，该方法非常适合于对一些糖蛋白进行全面和更深入的N-糖基化和N-聚糖分析。
图1：人尿液Umod的完整N-糖肽分析方法
此外，作者使用EThcD-sceHCD分析了完整的Umod n-糖肽，这种混合解离技术可以提供足够的解离效率和更多的片段信息。因此，基于优化后的工作流程，共鉴定了Umod中780个独有的完整的N-糖肽（7个N-糖基化位点和152个N-聚糖组成）并定量分析了760个完整的N-糖肽。
二、人尿液中Umod的N-糖基化位点特异性分析
作者进一步分析了不同的Umod处理方法中定量的N-糖肽，trypsin/Glu-C消化并进行HILIC富集是N-糖基化位点特异性分析的最佳处理方法，共鉴定302个位点特异性N-糖基化修饰（包括176个完整的N-糖肽由7个N-糖基化位点和142个N-聚糖组成）（图2A）。定量的前10个高丰度N-聚糖（基于信号强度）分别为复合型、高甘露糖型和唾液酸化（图2B）。大多数N-糖基化位点（N38、N232、N322、N396、N531）被数百个N-聚糖修饰，除了一个N-糖基化位点（N275）几乎完全被高甘露糖型占据。另外两个N-糖基化位点（N76和N80）被一个复合型的N-聚糖修饰（图2C）。
图2：Umod的N-糖基化位点特异性分析
三、IgAN患者尿液中Umod的N-糖基化差异分析
为了证明该工作流程在临床研究中的可行性，作者分析了健康队列HC组（n=9）和IgAN患者队列（n=9）中Umod的完整的N-糖肽（图3A），共定量到779个完整的Umod N-糖肽，对于每个HC样本，343.9±57.4完整的N-糖肽被定量（检出率为44.1±7.4）。然而，在每个IgAN样本中，只有41.8±70.8个完整的N-糖肽被定量（检出率为5.4±9.1）（图3B-C）。这些结果表明，与健康对照组相比，IgAN患者尿中Umod的N糖基化水平显著降低和丢失。N糖基化位点N396是IgAN中N-糖基化程度最高的位点。
图3：IgAN患者尿Umod N-糖基化差异分析
此外，作者对N-糖基化丰度进行差异分析，发现HC组和IgAN组之间有6个N糖基化位点的N-聚糖的均差异显著。重要的是，HC和IgAN组间Umod每个N-糖基化修饰的相对丰度和N-糖基化位点中前5个高丰度的N-聚糖丰度存在显著差异（图4）。因此，Umod的N糖基化谱可用于IgAN的非侵入性诊断。
图4：HC和IgAN组中Umod位点特异性N-糖基化修饰的相对丰度
总结
尿液中的糖基化蛋白组是一类潜在的生物标志物，对于疾病的早期筛查和治疗具有重要价值。Umod作为尿液中一种常见的蛋白质被广泛研究，本研究提出了基于硅藻土吸附法的人尿Umod分离方法，并利用HILIC富集技术以及EThcD-sceHCDMS/MS分析技术获得更完整的N-糖肽结果。深入研究尿液中UMOD的糖基化特征和组成，为疾病的诊断和治疗提供新的突破，这些研究对于实现精准医疗和个体化治疗具有重要的意义。
【参考文献】
Lin T, Chen Z, Luo M, Zhao Y, Zeng W, Zheng S, Su T, Zhong Y, Wang S, Jin Y, Hu L, Zhao W, Li J, Wang X, Wu C, Li D, Liu F, Li G, Yang H, Zhang Y. Characterization of site-specific N-glycosylation signatures of isolated uromodulin from human urine. Analyst. 2023 Sep 5. doi: 10.1039/d3an01018j.
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