维生素D（vitamin D,VD）是人体必需的一种脂溶性维生素，其与人体密切相关的是维生素D2(vitamin D2，麦角钙化醇)和维生素D3（vitamin D3，胆钙化醇）两种形式。VD3在肝脏中转化成25-(OH)D3，VD2转化为25-(OH)D2，这两种VD的代谢物被称为25-(OH)D，是VD在体内的稳定储存形式。
人体维生素D缺乏、代谢异常或过量均会影响肠道钙、磷吸收和骨代谢[1]。此外，维生素D与心血管细胞上的维生素D受体结合，低水平状态时，机体可通过激活促炎症瀑布导致内皮功能异常和动脉壁的硬度增加而加重心血管疾病的危险性[2]。维生素D受体亦存在于免疫系统的细胞中[3]，通过与受体结合可降低细胞因子（炎症蛋白质）水平，并且增加抗菌肽的含量，已有研究表明，充足的维生素D水平可预防呼吸道感染[4]。由于维生素D是一种脂溶性维生素，易储存于体内（主要肝脏），过量时可产生不良反应。因此，精准的检测结果可帮助临床准确评估人体维生素D营养状态、吸收障碍或毒性水平。
人体维生素D主要来源于皮肤经阳光作用合成的维生素D3，另一种来源是食物中（如经光照后的蘑菇、野生海鱼等）的维生素D2[5]，两者通过肝脏代谢后以2种形式存在，分别是25-(OH)D2和25-(OH)D3，虽然人体血液中超过95%的25-(OH)D为25-(OH)D3，但仍存在少量25-(OH)D2，若补充外源性25-(OH)D2，则体内可检测出浓度较高的25-(OH)D2，因此需分别对25-(OH)D2和25-(OH)D3进行定量检测[6]。
LC-MS/MS目前被认为是生物样本中维生素D类物质测量的“黄金标准技术”，与基于免疫分析的方法相比，LC-MS/MS测量方法的广泛应用提高了特异性，节约了成本。然而，该技术仍然存在一些局限性，主要与维生素D代谢物的低循环水平和大动态范围有关，从皮摩尔到纳摩尔水平跨越几个数量级，以及维生素D类物质分子具有亲脂性，缺乏适当的可以进行有效电离的功能基[7]。
英盛生物维生素D检测解决方案
英盛生物25-羟基维生素D测定试剂盒(高效液相色谱-串联质谱法)采用SLE（Supported Liquid Extraction）萃取技术，结合经典的PTAD（4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione）衍生化，并利用甲酸铵进一步提高衍生化合物的电离效率，从而极大提升了25-(OH)D3和25-(OH)D2的检测性能和效率。样品制备包括利用有机溶剂解离血浆蛋白结合的维生素D类物质、用SLE萃取解离的维生素D类物质和PTAD衍生化三个步骤。样品前处理后，使用反相C18色谱柱进行高速色谱分离，正离子电喷雾电离-串联质谱进行检测。同时使用相应的稳定同位素标记化合物作为内标，确保方法的准确度和可靠性。
衍生化与SLE萃取方法优势
样品的衍生化可将难于分析的物质转化为与其化学结构相似但易于分析的物质，在液质联用检测中可以提高离子化效率,降低基质抑制和减少无机盐及内源性杂质的干扰，从而极大增强目标物的信号响应，提高物质的灵敏度检测性能。此外，SLE萃取（固相支撑液液萃取）前处理方法优势突出：既可以有效去除粘性样本中（如血浆、血清或全血）的基质干扰物，如蛋白质与磷脂；又具有更好的重复性和更高的回收率，更低的检测限和更高的灵敏度；不仅是采用96孔样本板的设计，通量高，便于自动化可应用于萃取非极性化合物，能够满足临床高通量生物样品的检测要求，而且前处理过程中仅需上样和洗脱，进一步节约溶剂和时间；并且相对于传统的液液萃取而言，可避免乳化现象的产生。
参考文献：
[1] 中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会. 维生素D及其类似物的临床应用共识[J].中华内分泌代谢杂志, 2018, 34(3): 187‐200.
[2] 秦建华,王莉. 维生素D缺乏和心血管疾病危险因素关系的研究进展[J].中华临床医师杂志(电子版), 2016, 10(2): 279‐283.
[3] Lang PO, Samaras D. Aging adults and seasonal influenza:does the vitamin d status (h)arm the body? [J]. J Aging Res, 2012, 2012:806198.
[4] Martineau AR, Jolliffe DA, Hooper RL, et al. Vitamin D supplementation to prevent acute respiratory tract infections: systematic review and meta‐analysis of individual participant data[J]. BMJ, 2017, 356:i6583.
[5] 袁小芬, 马金飞, 杨青青, 等 . 液相色谱‐串联质谱技术在维生素检测中的应用[J]. 中华检验医学杂志, 2019, 42(6): 479‐483.
[6] 中国老年保健医学研究会检验医学分会,中国老年医学学会检验医学分会.液相色谱-串联质谱法检测25-羟维生素D标准化专家共识[J].中华检验医学杂志,2021,44(07):587-595.
[7] 王苏萍,吕海燕,林冰,陈彬彬,吴彩胜. SLE萃取法和PTAD衍生化法结合HPLC-MS/MS对血浆中VD3、VD2、25-(OH)D3和25-(OH)D2的检测[C].第九届全国治疗药物监测学术年会论文摘要集.,2019:179-180.
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