你可能在qPCR实验时有过疑问:
qPCR实验复孔为什么在平台期曲线高度不一样呢?对结果会有影响吗?
想要知道原因,先要了解为什么会有平台期。qPCR的扩增原理与大家熟知的普通PCR(Polymerase Chain Reaction)相同,随着扩增的进行,原料底物消耗或多次循环后聚合酶失活,扩增产物产量趋于稳定。那么如果原料底物等足量或者过量,酶活十分稳定,PCR是否还会有平台期呢?答案是肯定的,为什么依旧会存在平台期呢?
PCR扩增同样是一个酶促反应,符合酶促动力学原理。扩增中期产物量呈指数增长并逐渐积累,当引物-模板-酶达到一定比例时,酶促反应趋于饱和,产物不再增加,就会出现所谓的平台期。
前期研究表明,相同的样本开展多次重复实验,在平台期的重复性及稳定性差于指数期,不适用进行定量计算,因此qPCR结果基于指数期的数据计算。所以即使小伙伴发现qPCR实验复孔平台期不一致,但只要复孔间的△CT值小于0.5,并不会影响实验结果。
以玉米基因 NK603 构建的质粒为模板,在 TGreat Real 96 上使用 FP217 对同一样本开展 96 次重复定量实验。实验结果表明指数期的重复性及稳定性优于平台期。
当然有细心的小伙伴还会有疑问,使用不同厂家qPCR试剂,扩增相同基因也使用相同qPCR定量仪器进行定量分析,最后平台期的荧光强度为什么有区别?其实平台期荧光强度受多个因素的影响,包括产物量、试剂组分(如SYBR Green含量)等。
同一试剂微调组分后,扩增同一目的片段并使用 ABI QuantStudio 3进行qPCR上机分析,平台期荧光强度产生了较为显著的差异。
大家在挑选定量试剂时,应重点关注试剂的扩增效率、稳定性和特异性,TIANGEN定量明星试剂FastReal 快速荧光定量PCR预混试剂 (SYBR Green)(目录号:FP217),使用优化的PCR Buffer体系, 不仅试剂稳定性好,同时保证试剂的高扩增效率和产物的特异性。
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