总RNA提取实验——CsCl法

PBS异硫氰酸胍CsClDEPC无水乙醇

注射器电泳仪离心机培养箱

一、 用于单层培养细胞

1.  室温下用PBS冼涤细胞，每平皿用5 ml，洗2次。

2.  在不超过10⁸细胞中加入异硫氰酸胍溶液，并使之遍布整个平皿。

3.  用橡皮细胞刮子擦刮平皿，回收粘稠的细胞裂解液。

4.  用装有20-G针头的皮下注射器往返抽吸裂解物，并合并在一起。

二、用于悬浮培养细胞

1.  用JS-4，2转子离心回收≤10⁸细胞，重悬于相当于1/2原有体积的PBS，并再次离心回收细胞。

2.  往离心管中加入3.5 ml 异硫氰酸胍溶液。

3.  用装有20-G针头的6注射器将粘稠的细胞裂解液注返抽吸4次，并将其移至一个干净的试管中。

4.  在经硅化并高压过的13 mmx51 mm 的异质同晶聚合物超离心管中，加入1. 5 ml 5.7mol/l CsCl。

5.  并在此垫层上加入3.5 ml 细胞裂解液，界面应清晰。

6.  于18℃用Beckman SW-55转子150 000 g 离心12~20 h（缓慢加速和减速）。

7.  用巴斯德吸管的管尖在液面上吸取上清，管子随液面的下降而下降。

8.  当吸至仅剩约100 ul 时，小心倒置管子，倒出剩余液体。

9.  晾干沉淀约5~10 min，然后以360 ul TES溶液重溶沉淀，反复地以吸管上下抽吸。

10.  如此在室温进行5~10 min，转移溶液于另一干净的微量离心管。 

11.  加入40 ul 3mol/l pH5.2的乙酸钠缓冲液和1 ml 无水乙醇。

12.  在干冰/乙醇中沉淀30分钟，离心10~15 min，用360 ul 水重溶沉淀并重复沉淀过程。

13.  让沉淀晾干10 min，溶解于200 ul 水，取10 μl 稀释至1 ml 测A₂₆₀和A₂₈₀。

14.  以水溶液或乙醇沉淀的形式在-70℃贮存RNA。

1.  1~5步的操作均在室温进行。