核酸的定量测定实验——二苯胺法

2019.3.28

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实验方法原理	DNA 分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解, 产生2-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ-酮基戊醛, 后者与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物, 其反应为：蓝色化合物在595 nm 处有最大吸收峰, 且DNA 在40～400 μg 范围内时, 光密度与DNA 浓度呈正比。在反应液中加入少量乙醛, 可以提高反应灵敏度。
实验材料	蛋白质
试剂、试剂盒	小牛胸腺DNA NaOH 二苯胺纯冰醋酸过氯酸乙醛
仪器、耗材	试管吸量管容量瓶 722 分光光度计
实验步骤	1. 标准曲线的绘制: 取干燥试管6 支, 编号, 按下表加入试剂。加完后混匀, 于60 ℃恒温水浴中保温1 h , 冷却后于595 nm处比色测定, 以零号管调零点。以DNA 浓度为横坐标, 光密度为纵坐标, 绘制标准曲线。 2. 样品测定: 取试管3 支, 两支为样品管, 一支为对照管。对照管操作与标准曲线零号管相同。向每支样品管加2.0 ml 样品液及4.0 ml 二苯胺试剂, 60 ℃ 保温1 h , 冷却后于595 nm 处比色测定, 以对照管调零点。根据测得的光密度值从标准曲线上查出相应光密度的DNA 含量, 按下式计算DNA 百分含量。展开