无血清昆虫细胞培养基1～10 L 旋转培养瓶10.16 cm 管索张力器多旋转瓶揽拌台27℃ 培养箱供气泵

1. 在悬浮培养液中培养 Sf 9 细胞，并使之适应无血清培养液（基本方案 1）。

2. 准备旋转培养瓶，用于按比例扩增 Sf 9 细胞，将合适大小的两孔盖连接在转瓶的一个侧臂，另用一平盖接在另一侧臂（图 16.9.1）。将一段短管（约 15 cm）装在通气孔中，末端连接一滤器。借助张力器用管索将管子与通气孔和滤器加固。

3. 将一段长管（30～60 cm）连接至进气孔，并在末端连接一滤器。用管索加固。另一段管子连接于滤器的另一端，用管索加固。管子末端用铝箔封好。

4. 将与两孔装置相对的侧壁上的盖子旋转 90° 以松开，高压灭菌培养瓶 1 h。

5. 将适应了无血清培养液的 Sf 9 细胞（得自步骤 1）接种于经高压灭菌的培养瓶中。将培养瓶装至半满至全满之间（例如，在 3 L 瓶中装 1.5～3 L），加入足够的无血清培养液，使细胞终密度达到 5 × 10⁵～6 × 10⁵ 细胞/ml。

6. 将培养瓶放在 27℃ 培养箱中的磁力搅拌器上。将搅拌速度设置在 80 r/min。从进气 管的末端移去铝箔，并将它连接到供气泵。接通栗的电源，使其流量达到 500～700 ml/min。

7. 细胞生长至密度约 1.5 × 10⁵ 细胞/ml。在层流室中将感染复数（MOI）为 1～2 的病毒通过侧臂直接加到培养瓶中。

8. 27℃ 将培养瓶置于磁力振荡器上并通气。

9. 处理上清得到分泌蛋白或处理细胞得到胞内蛋白。

如果已有足够的细胞，可以以达到 1.5 × 10⁵ 个细胞/ml 的密度接种培养瓶。